金纳米笼侧向流免疫层析量热检测新方法及应用研究

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即时检测(point-of-care testing,POCT)技术对疾病诊断、环境监测和食品安全测试等领域的现场快速测试意义重大。以金纳米粒子(gold nanoparticles,GNPs)作为标记物的侧向流免疫层析(lateral flow immunochomatographic assay,LFIA)具有简便快捷、成本低廉、稳定可靠等诸多优点,成为目前应用最为广泛的POCT技术之一。但金标免疫层析法(gold immunochromatographic assay,GICA)主要依靠目视比色检测,检测灵敏度普遍低于基于荧光标记、放射性标记以及酶标记比色的其他免疫方法,而且不能实现待测物的定量检测。在保留侧向流免疫层析方便、快捷特性的基础上,研究新的LFIA纳米标记检测方法成为提高LFIA检测灵敏度的新趋势。金纳米笼(gold nanocages,GNCs)是具有可调节的表面等离子体光学特性的立方中空结构,通过调控其壁厚和边缘长度,可高效吸收400-1200 nm范围内的光。基于金纳米笼极佳的光热转换效率和良好的可修饰性,有望研究发展一种基于金纳米笼标记的侧向流免疫层析新方法。本论文基于金纳米笼优异的光热效应,研究了一种金纳米笼侧向流免疫层析量热检测新方法(calorimetric lateral flow immunoassay,CLFA),建立了双抗夹心法和间接竞争法两种免疫层析快检方法,分别用于蛋白质和小分子抗原的检测,并对CLFA光热图像的定理处理算法展开研究。主要包括以下内容:(1)制备了粒径均一、在808 nm处具有较强吸收、具有良好光热性能的金纳米笼;研究采用硫醇-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(thiol-polyethylene glycol-succinimide ester,HS-PEG-NHS)作为偶联剂,获得了稳定标记的免疫金纳米笼GNCs-Ab1。分别在水溶液和层析试纸条上对GNCs的光热性能进行了测试,优化了量热检测条件,并与球形金纳米粒GNPs的光热性能进行对比,证实了GNCs光热分析在高灵敏检测方面的优势。将GNCs量热分析与免疫层析法相结合,建立了基于双抗夹心免疫层析的金纳米笼光热检测AFP抗原的新方法。与AFP胶体金免疫层析商品化试剂盒的对比测试结果表明,采用金纳米笼CLFA量热法将AFP的检测灵敏度提高了约5倍。在对临床血清样品中AFP的检测实验中,金纳米笼CLFA量热法获得了与临床商用的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunonsorbent assay,ELISA)相近的检测结果,两种方法检测值的相对误差在3.0%至7.9%的范围内,进一步验证了金纳米笼CLFA量热新方法的技术可行性和可靠性,实现了AFP的快速、高灵敏定量检测。(2)利用GNCs量热检测的高灵敏度,集中针对小分子抗原进行免疫竞争层析检测技术研究。采用GNCs CLFA法检测饲料中玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的含量。受益于GNCs量热法更好精密度和更高灵敏度的双重优势,CLFA法无论是在低浓度区间还是高浓度区间的信号区分度都优于传统依赖视觉比色的胶体金侧向流免疫层析法(visual lateral flow immunoassay,VLFA),将方法的可检测浓度范围从GNPs VLFA的20-200 ng/m L,扩展到了5-500 ng/m L。进一步研究采用GNCs CLFA法检测唾液中甲基安非他明(MET)和毛发中芬太尼(FEN)的含量。相比GNPs VLFA法,GNCs CLFA法检出限降低了约2-3倍。以量子点荧光免疫分析作为对照方法,对疑似吸毒人员的毛发样品进行的实测结果表明,GNCs CFLA法与量子点荧光检测结果基本一致,达到了同等水平。基于GNCs CLFA量热法的高灵敏检测技术,不仅适用于双抗夹心法检测大分子抗原,也同样适用于间接竞争法检测小分子抗原。(3)提出了一种用于分割CLFA图像的新算法即结合快速峰检测的区域生长算法(region growing algorithm combined with fast peak detection,RGFPD)。RGFPD的实现主要包括两个步骤,第一步使用峰检测来获得信号区域的信息,为区域生长提供种子点和生长条件,还能有效区分干扰物和信号;第二步利用第一步提供的种子点和生长条件进行区域生长得到二值图像,再通过二值图像提取出信号区域,最后进行定量分析。与模糊C均值(fuzzy c-mean,FCM)算法和细胞神经网络(cellular neural network,CNN)算法比较分割性能的优劣,结果表明,新方法更加的快速、实用,较好地解决了侧向流免疫层析量热检测(CLFA)法的热像图存在的信号边界模糊、激光光斑不均一等问题,对减少人为误差、提高CLFA定量结果的准确性与重现性和真正实现现场即时检测具有现实意义。
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