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目的:神经管畸形（neural tube defects,NTDs）是常见的先天畸形之一,发生机制目前尚不清楚,部分患儿经过手术治疗可以存活,但尿、便失禁和下肢功能障碍是常见并发症,需要终生治疗,严重影响生活质量提高。因此,探讨NTDs诊断新方法对于早期干预治疗具有重要意义。目前NTDs产前诊断主要依靠影像学检查,但由于需要较高的诊断水平和昂贵的仪器设备,只能在大的产前诊断中心进行,而且影像学是在严重结构异常出现之后才能给予明确诊断,不能达到早期诊断和治疗的要求。母亲外周血分子标志物是有望能够在明显结构异常出现之前给予无创诊断的方法。但现有的诊断标志物,如甲胎蛋白,虽然在NTDs广泛筛查方面有一定意义,但缺乏良好的诊断特异性。寻找更早期、更特异的诊断标志物对于现今的临床诊断有着非常大的意义。现在,蛋白质组学筛查是相对成熟的寻找新分子标志物的方法。在课题组前期关于NTDs的研究中,利用蛋白质组学技术在脊髓、羊水、血清中发现了一些有可能成为诊断标志物的分子指标。近年来,随着外泌体方面研究的快速进展,发现外泌体可能是胎儿来源的分子进入母体外周血的重要途径,在外泌体中筛选分子标志物将会更容易找到畸形特异性的分子指标。由此,本研究利用蛋白质组学技术对外泌体中的蛋白质进行差异表达分析,试图寻找NTDs特异性蛋白标志物。另外,课题组前期研究发现骨架蛋白LMNA在怀有NTDs和先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）胎儿的母亲血清中均有下调趋势,并认为它可以作为新的诊断标志物。但是,胎儿来源的骨架蛋白LMNA不是分泌蛋白,如何透过胎盘屏障进入母血循环之中的机制尚不清楚。因此,本研究利用过表达LMNA-GFP融合蛋白的细胞模型探索其进入母血循环的途径和机制。研究方法:在第一部分研究中,我们利用维甲酸致NTDs的Wistar大鼠模型,对正常组与NTDs组的E18天孕鼠血清外泌体进行蛋白组学检测,并联合生物信息学分析寻找潜在的参与多种生物学功能的差异表达蛋白。在后续的验证中,我们利用Western blot和ELISA方法对筛选的蛋白标志物进行了扩大了样本量的变化趋势验证,并对E12至E18天的更早期血清外泌体进行了检测;利用Western blot和免疫组化（IHC）方法对其在脊髓组织表达情况进行了研究。在第二部分研究中,我们利用除草醚致CHD的c57小鼠模型,首先对正常组与畸形组的E17天孕鼠血清、血清外泌体、羊水、胎盘、心脏组织中的LMNA进行了Western blot及免疫组化分析。然后,我们构建了表达LMNA-GFP融合蛋白的质粒,转染羊水间充质干细胞。通过将转染后细胞及转染后细胞分泌的外泌体进行羊膜腔注射,观察GFP标记的LMNA在母体组织分布情况,探讨LMNA进入母血循环的途径与机制。结果:1、通过非标记定量（label-free）蛋白质组学技术联合生物信息学分析,在孕鼠血清外泌体中发现了3个在同一个蛋白互作网络中有联系的蛋白质:ACTR2、CORO1A和DNM2。这3个蛋白质均与F-肌动蛋白的聚合重构有关,而F-肌动蛋白与神经发育、神经管闭合、囊泡形成密切相关。2、运用Western blot和ELISA技术验证ACTR2、CORO1A和DNM2这3个蛋白质在孕早期E12天至E18天NTDs孕鼠血清外泌体中表达情况,发现均有下调趋势。同时对ACTR2、CORO1A和DNM2在血清中表达情况进行研究,发现在整体血清中没有没有明显变化,只在血清外泌体中存在明显下调趋势。3、运用Western blot和免疫组化技术对ACTR2、CORO1A和DNM2在脊髓组织中表达情况进行了研究,证明这3个蛋白质在组织中的变化与血外泌体中的变化趋势一致,并且发现了它们在脊髓组织、神经细胞中的特异性表达,特别是CORO1A和DNM2的表达更具有特异性,它们在胎儿神经源性外泌体中也有表达下调。4、运用ELISA检测CORO1A和DNM2在孕妇血清外泌体中的表达改变,证明了它们在怀有NTDs胎儿的妊娠12-40周孕妇血清外泌体中也有下调趋势,并且于妊娠早期（12-18周）的趋势更明显,诊断效果更好。5、利用Western blot验证除草醚致CHD的c57小鼠模型的LMNA蛋白在孕鼠血清中存在下调的变化趋势,并且在胎鼠心脏、羊水、胎盘也呈现表达下调,免疫组化结果也证明了这个趋势。同时发现了LMNA在羊水外泌体中有表达。6、成功构建了表达LMNA-GFP融合蛋白的细胞模型,利用Western blot检测和显微镜下观察都证明了LMNA-GFP融合蛋白的存在。7、利用表达LMNA-GFP融合蛋白的羊水间充质干细胞及其外泌体分别进行羊膜腔注射,在荧光体式显微镜下发现了在胎侧的荧光标记,并且通过Western blot检测GFP标签证明LMNA可以经由细胞迁移和外泌体途径进入母血循环。结论:1.孕妇血清外泌体中CORO1A和DNM2可能作为新的临床可以应用的NTDs早期无创诊断的分子标志物。2.ACTR2、CORO1A和DNM2在脊髓组织中低表达与NTDs发生有关。3.LMNA可以经由细胞迁移和外泌体途径从胎儿侧进入母血循环。