丁香中抑制脂肪酸合成酶表达及肥胖活性成分的鉴定与表征

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基于本实验室前期报道的丁香醇提取物(alcohol extract of clove,AEC)显著抑制脂肪酸合成酶(FASN)表达,能够改善小鼠肥胖的研究结果,本实验进一步探索了丁香醇提取物抑制FASN表达及肥胖的关键活性成分。结果主要如下:(1)初步发现丁香醇提取物中的齐墩果酸(oleanolic acid,OA)发挥了抑制FASN蛋白表达的作用。首先采用硅胶柱层析法初步分离丁香醇提取物得到7种组分,细胞增殖实验以及蛋白免疫印迹法发现组分5和6具有抑制前列腺癌细胞(LNCaP)增殖及FASN蛋白表达的作用。合并两个生物活性组分再一次进行硅胶柱分离得到3种组分(A、B、C),经液相色谱质谱联用(LC-MS)分析发现含有91.36%齐墩果酸的组分B具有抑制LNCaP增殖及FASN蛋白表达的作用。(2)丁香醇提取物中的齐墩果酸发挥了抑制LNCaP细胞生长、OP9细胞成脂分化,以及FASN蛋白表达的作用。细胞增殖实验发现齐墩果酸显著抑制LNCaP细胞生长且具有剂量依赖性,其IC50值约为40μM,共同添加棕榈酸时细胞活力显著恢复。蛋白免疫印迹法结果表明,40μM齐墩果酸、40μM FASN抑制剂C75以及100 mg/L丁香醇提物对LNCaP细胞中FASN蛋白表达的抑制效果一致。另外,齐墩果酸和丁香醇提物能够显著减少经罗格列酮诱导分化的OP9细胞的脂滴合成,且齐墩果酸抑制FASN表达的效果显著优于丁香醇提物和C75处理组。(3)丁香醇提取物中的齐墩果酸发挥了抑制高脂饮食诱导的小鼠肥胖的作用。高脂饮食诱导建立小鼠肥胖模型,饲养14周后发现,丁香醇提取物和齐墩果酸给药处理组在不影响进食量的条件下,与高脂对照组相比可显著降低高脂诱导肥胖小鼠的体重、肝脏和脂肪垫重量;H&E染色结果表明两种给药处理能够显著减小肥胖小鼠脂肪细胞体积,抑制小鼠肝脏和附睾脂肪组织中脂肪的积累;对小鼠血液进行生化分析发现两种给药处理可显著降低血液中总胆固醇、低密度脂蛋白和肝脏中谷丙转氨酶的含量。其中L剂量齐墩果酸与丁香醇提取物的各项指标具有高度一致性,而H剂量齐墩果酸处理组与正常饮食组的各项指标呈高度一致性。但糖耐量和胰岛素耐量实验表明丁香醇提取物能够显著提高小鼠胰岛素信号接受能力,对于抑制葡萄糖迅速升高的能力呈现改善态势,而齐墩果酸对两者没有明显的调节作用。最后通过PCR和蛋白免疫印迹分析发现,喂食丁香醇提物和齐墩果酸的小鼠肝脏中SREBP-1、Sp1、FASN的表达与HFD组相比均显著降低,而NF-Y基因的表达并没有明显变化。综上,本研究证明了丁香醇提物中的齐墩果酸发挥了其下调转录激活因子SREBP-1、Sp1以及FASN并抑制高脂饮食诱导的小鼠肥胖的作用,但在胰岛素敏感性方面丁香醇提物中存在除齐墩果酸之外的其他成分发挥作用。
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