【摘 要】
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火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey,HVT）是一种双链DNA病毒,基因组约为160～180 kb,庞大的基因组为外源基因提供多个插入位点。HVT是细胞结合性疱疹病毒,可在携带有高水平母源抗体的禽类体内繁殖,并可终身感染,可诱导宿主产生细胞免疫和体液免疫。基于以上特性,重组HVT载体疫苗具有成为多联多价疫苗的潜力。2016年中新出现的高致病性H7N9亚型禽流感病毒（Avain
【基金项目】
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国家自然科学基金（31830097、31672586、U1501212）； 广东省重点领域研发计划项目（2019B020218004）； 广东省自然科学基金项目（2015A030313422）； 国家肉鸡产业技术体系项目（nycytx-42）； 广
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火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey,HVT）是一种双链DNA病毒,基因组约为160～180 kb,庞大的基因组为外源基因提供多个插入位点。HVT是细胞结合性疱疹病毒,可在携带有高水平母源抗体的禽类体内繁殖,并可终身感染,可诱导宿主产生细胞免疫和体液免疫。基于以上特性,重组HVT载体疫苗具有成为多联多价疫苗的潜力。2016年中新出现的高致病性H7N9亚型禽流感病毒（Avain influenza virus,AIV）,导致家禽急性死亡,并且可以感染人,造成严重的经济损失和公共卫生安全。疫苗策略可以减少AIV在家禽的传播,从而促进家禽养殖业的发展和公共卫生安全。以HVT为载体的禽流感疫苗克服了传统灭活苗的缺点:不受母源抗体干扰、终生免疫等,是一种新型有潜力的疫苗,已经有商品化的产品在国外上市。本研究首先建立了构建重组HVT载体疫苗的方法,即通过传统同源重组技术,把表达绿色荧光蛋白的EGFP（Enhanced green fluorescent protein）标记基因表达盒（MCMV+EGFP+SV40poly A）插入到HVT基因组HVT065和HVT066之间,获得表达绿色荧光蛋白的重组火鸡疱疹病毒（r HVT-EGFP）。利用电转染技术提高原代细胞转染效率,从而提高转移质粒和病毒基因组同源重组的效率。利用有限稀释法和以SPGA为保护剂的超声细胞破碎技术解决了筛选纯化细胞结合性疱疹病毒的难题。通过PCR鉴定和荧光显微镜观察,证明成功构建出r HVT-EGFP,成功建立重组HVT方法。利用以上建立的方法把表达高致病性H7亚型禽流感病毒血凝素（Hemagglutinin,HA）的基因表达盒（MCMV+H7HA+SV40poly A）插入到HVT基因组HVT065和HVT066之间,构建出一株表达高致病性H7亚型禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒（r HVT-H7HA）。r HVT-H7HA表达的HA蛋白可以凝集鸡红细胞;通过蛋白免疫印迹可以在感染r HVT-H7HA病毒的CEF（Chick embryo fibroblast）细胞内能检测到蛋白的表达,随着r HVT-H7HA培养时间的延长,HA蛋白表达量不断增加随后趋于稳定。r HVT-H7HA在CEF细胞上的增殖曲线结果表明,r HVT-H7HA随着培养时间的延长,病毒滴度不断增加,在96 h到达高峰随后迅速下降。r HVT-H7HA在CEF上的增殖能力低于亲本毒株。在CEF上对r HVT-H7HA进行体外传代稳定性分析结果表明,r HVT-H7HA至少可在体外稳定传15代。重组病毒r HVT-H7HA免疫SPF鸡后,结果表明免疫5周后平均抗体滴度约为3log2;随后用105EID50高致病性H7N9亚型禽流感病毒（A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016）以鼻腔攻毒的方式进行攻毒实验,攻毒后观察14 d,免疫1500 PFU组和免疫5000 PFU组的保护率均达到90%。
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