【摘 要】
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转基因大豆是目前最主要的转基因作物,我国作为全球转基因大豆消费最大的国家,建立转基因检测方法对加强口岸转基因大豆的有效监控及加工食品安全具有重要意义。MON87705、MON87708和MON89788是全球种植量较大并且比较重要的转基因大豆品系,本研究针对以上三个品系建立一种精准、高效的四重数字PCR转基因成分定量检测方法。主要研究内容和结果如下:（1）方法参数优化。根据大豆内源Lectin基因
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转基因大豆是目前最主要的转基因作物,我国作为全球转基因大豆消费最大的国家,建立转基因检测方法对加强口岸转基因大豆的有效监控及加工食品安全具有重要意义。MON87705、MON87708和MON89788是全球种植量较大并且比较重要的转基因大豆品系,本研究针对以上三个品系建立一种精准、高效的四重数字PCR转基因成分定量检测方法。主要研究内容和结果如下:（1）方法参数优化。根据大豆内源Lectin基因序列及MON87705、MON87708、MON89788品系特异性序列信息设计多套引物探针,采样单重实时荧光PCR方法筛选出合适引物探针。采用双重实时荧光PCR方法对不同引物探针之间进行组合及浓度比例的初步调整,根据较佳的双重引物探针组合,进一步优化四重数字PCR引物探针浓度,从而确定最适宜的四重数字PCR反应体系:Lectin基因和MON89788品系特异性序列上、下游引物各0.9μL（终浓度为900 nmol/L）,探针0.5μL（终浓度为125 nmol/L）,MON87705和MON87708品系特异性序列上、下游引物各1.8μL（终浓度为900 nmol/L）、探针0.5μL（终浓度为250 nmol/L）。然后设置52～60℃的退火温度梯度,对反应条件程序进行优化,确定最佳退火温度为58℃。（2）方法验证。通过特异性、可重复性和重现性、精密度、定量线性范围、灵敏度测定以及实际样品的适用性测试,对建立的转基因大豆四重数字PCR方法进行验证。测定结果表明,本研究建立的四重数字PCR定量检测方法对转基因大豆MON87705、MON87708、MON89788品系具有高度的特异性;方法具有很好的可重复性和重现性;定量检测灵敏度可达0.1%,且定量精准;各目标基因呈现良好定量线性、定量范围广,检出限（LOD）可达单个拷贝,适用于低含量转基因成分精准定量;在16批实际样品定量检测中四重数字PCR方法表现出良好的适用性。（3）测量不确定度评估。分析四重数字PCR定量检测方法的不确定度来源,通过统计学方法计算不同浓度下四个目标基因的A类不确定度（uA）,采用非统计学方法评估B类不确定度（uB）,分析定量过程中主要不确定度来源,并计算出合成不确定度（uC）。结果显示,在目标基因浓度较高时,A类不确定度中重复测量产生的不确定度在所有不确定度来源中占主导位置,各个B类不确定度分量的不确定度相对较小,而随着目标基因浓度的减小,分配误差逐渐成为主要不确定度来源。根据不确定度结果显示,本研究针对转基因大豆MON87705、MON87708、MON89788三个品系建立的四重数字PCR检测方法在目标基因为32～8197拷贝时测定更为精准。
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