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一、研究背景、目的与意义支气管哮喘(后文简称哮喘)是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞等多种细胞和细胞介质参与呼吸道慢性炎症。全球约有一亿五千万到二亿人罹患哮喘,在我国,约有1500—2000万哮喘患者,且在儿童及青少年中,其发病率较成人高。特别是近20年来,哮喘发病率和死亡率持续增加,目前仍以每十年20%～50%的比率增长,哮喘已成为仅次于癌症的世界第二大致死和伤残疾病。EOS在介导气道炎症参与哮喘病发病的调节中起重要作用,是哮喘发病机制中的主要效应细胞。TNF-α是哮喘病炎症过程中重要的启动因子,它还刺激ET-1分泌增加,进一步导致平滑肌细胞增殖、成纤维细胞增殖等,可能是参与气道高反应性及气道重构的重要机制之一。ET-1作为前炎性介质可增加TNF-α等的生成,而且ET-1合成、分泌增加可能是联系哮喘气道炎症和重构的关键性环节。这三者均与哮喘气道炎症密切相关,且TNF-α与ET-1有可相互促进分泌增加的效应,并且能够影响气道高反应性。经皮治疗系统(transdermal therapeutic system,TTS),或称经皮给药系统(transdermal delivery system,TDDS),一般是指经皮肤给药而起全身治疗作用的控释剂型,即皮肤贴片。它可以不经过肝脏的“首关效应”和胃肠道的破坏,不受胃肠道酶、消化液、PH等诸多因素的影响,可提高生物利用度,提供可预定的和较长的作用时间,降低药物毒性和副作用,维持稳定而持久的血药浓度,减少给药次数提高疗效。天灸又称药物灸、发泡灸,是用对皮肤有刺激性的药物,涂敷于穴位或患处,使局部充血、起泡,犹如灸疮,故名天灸。古代的天灸疗法也是通过药物经过人体体表吸收后,再刺激穴位并同时作用于相关的脏腑而发挥治疗作用的,即通过药物与经络的双重作用达到治疗疾病的目的。天灸大量的实验研究已证实,天灸疗法具有调整和增强机体免疫功能的作用,主要对细胞因子、白细胞、T淋巴细胞进行调节。天灸疗法作为一种传统的中医疗法,在治疗支气管哮喘方面有较为显著的临床疗效。本课题是将经皮控释给药系统(TDD)与中国古代传统的天灸疗法相结合,在天灸原方的基础上进行剂型的改良,开发的“天灸TDD药贴”。为探讨穴位贴敷TDD药贴对哮喘豚鼠模型哮喘发作的可能干预机制,本研究应用穴位贴敷TDD药贴干预哮喘豚鼠模型,观察各组致敏豚鼠喷雾时发生哮喘的潜伏期(开始喷雾至出现点头呼吸的时间)及发作时症状、轻重程度(如点头呼吸频率、幅度,抽搐,晕厥等)等情况,并主要测定卵白蛋白(OVA)致敏哮喘豚鼠血清中TNF-α、ET-1含量和支气管及肺组织中EOS浸润计数。通过比较各组哮喘豚鼠在治疗周期结束后,血清中TNF-α、ET-1的含量及支气管肺泡组织中EOS浸润计数情况,探究天灸TDD药贴对OVA致敏哮喘豚鼠模型的抗炎、减轻气道痉挛及降低气道高反应性等可能的作用机制,进而为天灸TDD药贴对哮喘是否具有抗炎、减轻气道痉挛及降低气道高反应性等作用的研究提供一个客观的、重复性好的临床前实验室依据,并为今后TDD药贴在临床上推广应用提供理论依据。二、方法与内容1.实验动物及哮喘模型制备实验研究选择豚鼠作为实验动物。将48只豚鼠随机分为4组:正常对照组、模型对照组、TDD药贴组和地塞米松组。用卵白蛋白致敏法制作实验性豚鼠过敏性哮喘模型。第1天以10%(10g/100ml)卵清蛋白生理盐水溶液腹腔注射1ml致敏。2.造模后诱喘及干预治疗致敏2周后,豚鼠处于致敏状态,再以1%(1g/100ml)卵清蛋白生理盐水溶液超声雾化吸入,至豚鼠出现烦躁、呛咳、呼吸深快和点头运动;隔天激发1次,共两周。TDD药贴组和地塞米松组豚鼠分别采用穴位贴敷TDD药贴(大椎、双肺俞、双肾俞)和腹腔注射地塞米松进行干预治疗。在每次超声雾化激发后,TDD药贴组进行穴位贴敷治疗,地塞米松组采用腹腔注射地塞米松0.5mg/kg,两组均隔天干预治疗1次,共7次。模型对照组和正常对照组不给予任何干预治疗。3.症状观察及样本制备3.1症状观察:从致敏成功后诱喘开始至动物处死前的实验期间,观察各组豚鼠喷雾时发生哮喘的潜伏期(开始喷雾至出现点头呼吸的时间)及哮喘发作时症状、轻重程度(如点头呼吸频率、幅度,抽搐,晕厥等)。3.2样本制备:在末次诱喘后2～4h内,迅速断头取血,离心后取上清液,放冰箱保存待测。处死豚鼠完成取血后,立即用手术剪打开胸腔,暴露肺脏,取右侧支气管组织及肺门处肺组织1mm×1mm大小各4块,经10%的甲醛溶液固定,24h后常规石蜡包埋,冠状切片。4.豚鼠血清中TNF-α、ET-1含量和支气管肺泡组织中EOS计数的检测采用酶联免疫吸附法定量检测各组豚鼠血清中TNF-α、ET-1的含量;病理学检查主要观察支气管及肺组织中EOS浸润程度,其观察方法是经HE染色后,光学显微镜下每个样本取细支气管肺泡区随机观察5个高倍视野(10×40),计数其支气管肺泡组织浸润的EOS数,取平均值作为该样本EOS浸润计数。5.统计方法所得数据应用SPSS13.0软件进行统计分析。计量数据以(?)±S表示,各组豚鼠血清中TNF-α、ET-1含量及支气管肺泡组织中EOS浸润计数检测结果比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐多重比较用LSD法检验,方差不齐用近似F检验Welch或Brown-Forsythe法,以P＜0.01、P＜0.05作为具有统计学意义的标准。三、研究结果1.各组豚鼠哮喘发作的潜伏期及哮喘发作时的症状轻重程度从造模成功诱喘开始至干预治疗结束,我们观察到:造模成功后开始诱喘,除正常对照组外,其余3组豚鼠哮喘发作的潜伏期及哮喘发作时的症状轻重程度相当。在干预治疗过程中,模型对照组豚鼠哮喘发作的潜伏期最短、哮喘发作次数最多且哮喘发作时的症状最重,而TDD药贴组与地塞米松组豚鼠的哮喘潜伏期较模型对照组明显延长,哮喘发作次数也明显减少,且哮喘发作时的症状也较干预治疗前明显减轻。2.穴位贴敷TDD药贴对哮喘豚鼠血清中TNF-α和ET-1含量的影响采用酶联免疫吸附法定量检测血清中TNF-α和ET-1含量的结果表明:模型对照组豚鼠血清中TNF-α和ET-1含量明显高于正常对照组,具有显著性差异(P＜0.01),说明哮喘豚鼠血清中TNF-α和ET-1含量显著增加,即造模成功,也表明血清中TNF-α和ET-1含量与哮喘密切相关。TDD药贴组、地塞米松组豚鼠血清TNF-α和ET-1含量明显低于模型对照组,具有显著性差异(P＜0.01),说明两种干预措施均可降低哮喘豚鼠血清中TNF-α和ET-1的含量。TDD药贴组、地塞米松组豚鼠血清TNF-α含量与正常对照组比较,具有显著性差异(P＜0.01);地塞米松组豚鼠血清ET-1的含量与正常对照组相比,无显著性差异(P＞0.05),而TDD药贴组豚鼠血清中ET-1的含量与正常对照组、地塞米松组相比有显著性差异(P＜0.01),说明TDD药贴对哮喘豚鼠血清中ET-1含量的影响不如地塞米松注射液明显。3.穴位贴敷TDD药贴对哮喘豚鼠支气管肺泡组织中EOS浸润计数的影响光学显微镜下观察支气管肺泡组织中EOS浸润计数情况:模型对照组豚鼠支气管肺泡组织中EOS浸润计数明显高于正常对照组,且具有显著性差异(P＜0.01),说明哮喘豚鼠模型支气管肺泡组织中EOS浸润明显。TDD药贴组和地塞米松组豚鼠支气管肺泡组织中EOS浸润计数均明显低于模型组,具有显著性差异(P＜0.01),而TDD药贴组和地塞米松组豚鼠支气管肺泡组织中EOS浸润计数却又明显高于正常对照组,具有显著性差异(P＜0.01),表明TDD药贴和地塞米松注射液均可减轻哮喘豚鼠支气管肺泡组织中EOS浸润,对支气管哮喘有一定的治疗作用,但并不能完全消除支气管肺泡组织中的EOS。四、结论本实验研究发现穴位贴敷TDD药贴不仅能够延长哮喘豚鼠模型哮喘发作的潜伏期、减少哮喘发作的次数、减轻哮喘发作时的症状,且能够减少哮喘豚鼠模型支气管肺泡组织中EOS数、降低哮喘豚鼠模型血清中TNF-α和ET-1的含量。本实验研究提示:穴位贴敷TDD药贴是通过药物刺激穴位的同时药物透过皮肤进入血液循环而直达病灶来减少哮喘豚鼠支气管肺泡组织中EOS数,降低哮喘豚鼠血清中TNF-α和ET-1的含量,从而达到抑制气道炎症的发生与发展、减轻气道痉挛、降低气道的高反应性,发挥干预气道炎症及气道高反应性的作用,还可能影响到气道的重构情况。