屏边三七为五加科人参属植物屏边三七Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng的根及根茎,具有“消炎定痛,保肝抗癌”之功效,含有齐墩果烷型五环三萜类皂苷成分,民间对于治疗肝炎具有良好的效果。目前屏边三七是一种待开发的、具有高经济价值的药用植物资源,前期研究发现屏边三七皂苷具有保肝作用,但其作用机制尚不清楚。因此,本文考察了屏边三七皂苷抑制肝纤维化的作用机制,一方面,利用经典炎症细胞模型脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞,探究屏边三七皂苷对NF-κB通路上相关蛋白和细胞因子的影响,另一方面利用活化大鼠肝星状细胞（HSC-T6）及四氯化碳（CCl₄）致大鼠肝纤维化模型从体外体内探讨了屏边三七皂苷对TGF-β₁/Smad信号通路介导的肝纤维化的抑制作用。本次主要研究内容与结果如下:1.屏边三七总皂苷（PS）、屏边三七皂苷R₁（PS-R₁）和屏边三七皂苷R₂（PS-R₂）对LPS诱导的RAW246.7细胞NF-κB信号通路的影响。1.1屏边三七皂苷对Raw264.7细胞存活率的影响。PS在浓度为0.02～1 mg/mL时,对细胞存活率无抑制作用;PS-R₁和PS-R₂在浓度为1～30μmol/L时,对细胞存活率无明显抑制作用,而PS-R₁和PS-R₂在浓度达到50μmol/L时,细胞活性受到一定的抑制作用。1.2屏边三七皂苷对LPS诱导Raw264.7细胞产生一氧化氮（NO）的抑制作用。PS在浓度为0.02～0.5 mg/mL时可显著降低Raw264.7细胞分泌的NO含量（p<0.05,p<0.01,p<0.001）,且有一定的剂量依赖性。PS-R₁在浓度为1～30μmol/L时均可显著降低Raw264.7细胞分泌的NO含量（p<0.05,p<0.01）,而PS-R₂无抑制作用。1.3屏边三七皂苷对LPS诱导Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子（TNF）-α含量变化的影响。PS在浓度为0.1～0.5 mg/mL时、PS-R₁和PS-R₂在浓度为1～30μmol/L时均对LPS诱导Raw264.7细胞上清液中TNF-α含量有下调作用（p<0.05,p<0.01）。1.4屏边三七皂苷对LPS诱导的Raw264.7细胞中转录因子（NF-κB）和白细胞介素IL-1βmRNA水平的影响。PS（0.5 mg/mL）抑制了IL-1β的mRNA表达（p<0.001）,而对NF-κB无明显抑制作用;PS-R₁（30μmol/L）和PS-R₂（30μmol/L）显著抑制了细胞中NF-κB和IL-1β的mRNA表达（p<0.01）。1.5屏边三七皂苷对LPS诱导的Raw264.7细胞中NF-κB蛋白表达的影响。PS对Raw264.7巨噬细胞中细胞核NF-κB蛋白的表达有抑制作用,且对浓度有依赖性。当浓度达到0.5 mg/mL时,其抑制效果最显著。PS-R₁和PS-R₂对细胞核NF-κB蛋白的表达抑制作用不显著。2.屏边三七皂苷对大鼠肝星状细胞TGF-β₁/Smad信号通路的影响2.1屏边三七皂苷对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）细胞存活率的影响。PS在浓度为0.02～1 mg/mL时对HSC-T6细胞的增殖和生长无明显抑制作用;PS-R₁在浓度为0.5～30μmol/L时对HSC-T6细胞,无明显抑制作用,当浓度达到50μmol/L时,对HSC-T6细胞的增殖和生长有一定的抑制作用;PS-R₂在浓度为1～100μmol/L时对HSC-T6细胞无明显抑制作用。2.2屏边三七皂苷对HSC-T6细胞中转化生长因子（transforming growth factor-β1,TGF-β₁）、平滑肌蛋白（α-SMA）、Smad3和Smad4 mRNA水平的影响。PS在浓度为0.1～0.5 mg/mL时,对HSC-T6细胞中α-SMA、Smad3和Smad4的mRNA水平均有明显的下调作用,且具有一定的浓度依赖性（p<0.05,p<0.01,p<0.001）。PS在浓度0.5 mg/mL时,对TGF-β₁ mRNA表达有显著抑制作用（p<0.001）,而在低浓度时无影响。PS-R₁在浓度为1～30μmol/L时,对HSC-T6细胞中α-SMA mRNA水平均有显著下调作用（p<0.01,p<0.001）。在高浓度30μmol/L时,PS-R₁对TGF-β₁、Smad3及Smad4水平有显著下调作用（p<0.05,p<0.001）。PS-R₂在浓度为1～30μmol/L时,对HSC-T6细胞中α-SMA mRNA水平有显著的下调作用（p<0.01,p<0.001）,而对TGF-β₁ mRNA水平无显著影响。在高浓度30μmol/L时,PS-R₂显著抑制了HSC-T6细胞中Smad3、Smad4 mRNA水平（p<0.05,p<0.01）。2.3屏边三七皂苷对HSC-T6细胞中α-SMA、Smad3、Smad4及NF-κB蛋白表达的影响。Western Blot分析表明,PS在浓度为0.1～0.5 mg/mL时,对HSC-T6细胞中Smad3、α-SMA、NF-κB的蛋白表达均有显著的下调作用,且呈剂量依赖性,而其对Smad4蛋白表达无明显抑制作用。PS-R₁和PS-R₂在浓度为1～30μmol/L时,对HSC-T6细胞中Smad3的蛋白表达均有显著的下调作用,且具有一定的浓度依赖性。PS-R₁和PS-R₂对α-SMA和Smad4在HSC-T6细胞内的蛋白表达有一定的抑制作用。2.4屏边三七皂苷与蛋白Smad3、Smad4的分子对接情况。结果表明,PS-R₂与Smad3蛋白结合效果最好,亲和度最高。PS-R₂结合到Smad3蛋白活性位点,与活性位点的蛋白具有较好的匹配,切合活性位点的Gln386、Val 385、Asn400、Thr 246、Ser 235、Tyr 237形成氢键相互作用,这些相互作用促进了小分子稳定结合到蛋白活性位点从而发挥生物活性。3.屏边三七皂苷对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠TGF-β₁/Smad信号通路的影响。3.1屏边三七皂苷对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠血清中ALT、AST的影响。与空白组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST水平显著增加（p<0.001）。与模型组相比,各剂量给药组PS（100、150、200 mg/kg）显著降低ALT、AST含量（p<0.05,p<0.01,p<0.001）。PS-R₂中剂量组（10 mg/kg）、高剂量组（30 mg/kg）显著降低ALT、AST含量（p<0.01,p<0.001）,其中低剂量组无显著差异。3.2屏边三七皂苷对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠肝脏组织病理切片的影响。大鼠肝脏组织病理切片结果分析表明,空白组大鼠肝细胞形态正常,未见纤维沉积,无病理性改变;模型组大鼠肝细胞排列紊乱,肝细胞坏死明显,汇管区纤维组织增生明显,明显病理性改变。与模型组相比,PS、PS-R₂低剂量组（100、1mg/kg）的大鼠汇管区纤维结缔组织增生略微减轻;PS中、高剂量组（150、200 mg/kg）及PS-R₂中、高剂量组（10、30 mg/kg）中大鼠肝脏汇管区仅有少量纤维组织增生,肝细胞变性坏死明显减轻,少量淋巴细胞浸润;其中高剂量肝损伤程度较轻于阳性组。3.3屏边三七皂苷对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠肝组织内NF-κB信号通路上NF-κB和p-NF-κB蛋白表达的影响。Western Blot分析表明,与模型组相比,PS在浓度为100～200mg/kg时,对肝组织中NF-κB和p-NF-κB的蛋白表达均有显著的下调作用。PS-R₂在浓度为1～30 mg/kg时,对肝组织中NF-κB和p-NF-κB的蛋白表达均有显著的下调作用,且呈现浓度依赖性。3.4屏边三七皂苷对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠肝组织内TGF-β₁/Smad信号通路上Smad3和Smad4蛋白表达的影响。与模型组相比,PS和PS-R₂在浓度分别为100～200 mg/kg、1～30 mg/kg时,对肝组织中Smad3和Smad4的蛋白表达均有显著的下调作用,且具有一定的浓度依赖性。3.5屏边三七皂苷对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠肝组织内TGF-β₁/Smad信号通路中TGF-β₁、Smad3和Smad4蛋白免疫组化检测结果。免疫组化检测结果显示,与空白对照组相比,模型组大鼠肝脏中TGF-β₁、Smad3/4蛋白水平显著增加;与模型组相比,给药PS高剂量组（200 mg/kg）显著下调TGF-β₁、Smad3/4蛋白水平,而PS-R₂抑制作用不显著。综上所述,屏边三七总皂苷及其单体皂苷对肝纤维化具有保护作用,可能与TGF-β₁/Smad及NF-κB双信号途径相关。