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过氧化物酶体(Peroxisome)是一类重要的细胞器,含有多种生化反应的关键酶,参与过氧化氢代谢、脂肪酸β-代谢和乙醛酸循环等多种重要的生物学代谢过程。在真菌中已经报道有多种蛋白质参与过氧化物酶体的生物合成,这些蛋白称为Peroxins,编码这些蛋白的基因称为PEX,所对应蛋白则为Pexp。Peroxins主要有基质蛋白和膜蛋白,其中Pex3p、Pexl6p和Pex19p参与过氧化物酶体膜蛋白的合成和转运以及定位。同时,过氧化物酶体也是脂肪酸代谢的场所,其中过氧化物酶体多功能氧化蛋白(Peroxisomal β-oxidation multifunctional protein,MFP)就在其中起着重要的作用,它的编码基因则为Mfp。寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)是研究捕食线虫真菌与线虫相互作用的代表菌株,它在捕食线虫的过程中产生三维菌网捕器捕捉和侵染线虫。本论文选取寡孢节丛孢中与过氧化物酶体膜蛋白合成相关基因PEX3(AOL__s00215g610)、PEX16(AOL__s00007g540)和PEX19(AOL_s00188g3);同时选择了编码MFP蛋白的两个基因Mfp1(AOL__s00054g29)和Mfp2(AOL__s00076g393)作为研究对象,探究其在寡孢节丛孢的生长发育、抗逆性、产孢和捕食线虫等过程中所起到的作用。主要研究结果1.过氧化物酶体膜蛋白及MFP保守结构域、理化性质和聚类分析通过保守结构域分析表明,寡孢节丛孢中Pexp蛋白家族中,Pex3蛋白含有Peroxin-3(IPR006966)保守结构域;Pex16蛋白含有Pex16(IPR013919)保守结构域;Pexl9蛋白有含有Pex19 protein(IPR006708)保守结构域。而MFP蛋白家族中,两个MFP蛋白都具有HotDog超家族结构域(IPR029069)和参与单胺氧化酶合成的MaoC-like脱水酶的功能位点(IPR002539),除此之外MFP1还含有短链脱氢还原酶功能位点(IPR002347)和NADP结合的超家族结构域(IPR036291)。另外,分别对Pexp和MFP的分子量和等电点进行了预测,Pexp家族中,Pex3p含有454个氨基酸残基,分子量为50.7kDa,Pex16p和Pex19p的氨基酸残基数目和分子量较小,三者等电点差异都比较大。MFP家族中,MFP1和MFP2的氨基酸残基数目和分子量差异很大,氨基酸数目分别为901和313,分子量则分别是96.3 kDa和34.3 kDa,两者的等电点差异较小,分别为8.1与9.54。在聚类分析中,Pexp系统发育树含有三个主要的分支,而Pex3、16和19蛋白位于这三个不同的分支上。MFP系统发育树含有两个主要分支,MFP1和MFP2也分别位于两个不同的分支上。2.Pex膜蛋白和MFP编码基因的敲除和相关表型特征比较利用同源重组的方法,成功将三个膜蛋白合成相关基因(PEX3,PEX16和PEX19)和两个参与脂肪酸代谢的MFP基因(Mfp1和Mfp2)敲除。除Mfp2外,每个基因均获得了两个以上的转化子。在表型实验中发现敲除了PE 三个膜蛋基因之后,敲除株都不能产生孢子,也不能产生捕器,突变株的杀线虫能力极大的降低;同时突变株营养菌丝生长的速度变慢,菌丝出现不同程度的弯曲,且一定程度变细,隔间距对比野生型变短;此外,突变株对脂肪酸的利用能力也出现了下降;抗逆性实验结果表明,突变株的抗氧化性和抗细胞壁合成能力与野生型有一定的差异。而△MFP敲除株中,△Mfp2在脂肪酸利用能力上出现了一定程度的降低,其他抗逆性实验表型和野生型差异不大;产孢能力上,△Mfp1产孢数目略微下降,△Mfp2产孢数量则稍许增加;孢子萌发速率△Mfp1无明显差异,△Mfp2在4 h和8 h略微滞后于野生型;杀线虫能力无明显差异。本论文的创新点1.成功敲除PEX三个膜蛋白基因和MFP两个基因,并发现PEX三个膜蛋白基因参与了寡孢节丛孢的生长、产孢和杀线虫等重要的生物学过程的调控。