【摘 要】
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宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,在我国每年的新发病例数有十万之多,成为女性生命健康的巨大威胁。宫颈癌的主要治疗方式有手术和（或）放射治疗,但是晚期宫颈癌和宫颈癌术后复发、转移的宫颈癌需联合全身化疗,癌细胞对常规的化疗药物的耐药性及药物产生的副作用是治疗宫颈癌的阻碍。因此,寻找新的抑癌药物是目前研究的热点。细胞凋亡是正常细胞为适应内外环境的程序性死亡,正常细胞因为某种原因过度增殖后易形成异型性细
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宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,在我国每年的新发病例数有十万之多,成为女性生命健康的巨大威胁。宫颈癌的主要治疗方式有手术和（或）放射治疗,但是晚期宫颈癌和宫颈癌术后复发、转移的宫颈癌需联合全身化疗,癌细胞对常规的化疗药物的耐药性及药物产生的副作用是治疗宫颈癌的阻碍。因此,寻找新的抑癌药物是目前研究的热点。细胞凋亡是正常细胞为适应内外环境的程序性死亡,正常细胞因为某种原因过度增殖后易形成异型性细胞产生癌变,因此,诱导细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的方法之一。细胞凋亡最终都会引起细胞内酶联反应发生,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase）家族中蛋白被激活,引起细胞凋亡。在细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种功能的调节中,磷酯肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3k）/蛋白激酶B（Akt）信号通路有重要作用。研究发现许多天然有机物具有抑癌作用,如生物碱、皂角、多糖等。天然产物对癌细胞的治疗是近些年研究的热点,据文献报道从莲子中提取的一种有效成分甲基莲心碱（Neferine,Nef）在多种癌细胞中参与细胞的功能调节,如肺癌、胃癌、肝癌等。所以,我们试图研究Nef对宫颈癌细胞的影响及分子机制,以期寻找有效治疗宫颈癌的新方法。体外培养宫颈癌Hela细胞,通过不同浓度的Nef(0,10,15,20,25,30μg·ml-1)处理Hela细胞,通过CCK-8检测不同时间、不同浓度的Nef作用后的细胞增殖能力,根据吸光度OD值,计算Hela细胞的细胞活性;通过光学显微镜观察Hela细胞的形态变化;然后用TUNEL检测法观察细胞的凋亡情况、流式细胞仪（FCM）检测Hela细胞的凋亡率,Western Blot检测Hela细胞内BAX、Bcl-2、激活型Caspase-3以及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt等PI3K/Akt信号通路中的通路蛋白表达情况。进一步构建宫颈癌裸鼠异体瘤荷瘤模型,设置甲基莲心碱低剂量组（Nef 1.5mg/kg）和高剂量组（Nef 3.0mg/kg）,并以生理盐水和顺铂组（DDP）2.0mg/kg作为对照,每天一次腹腔注射给药观察瘤体积大小,隔日测量并记录。实验结束后脱颈法处死裸鼠,取瘤组织称重测量,计算抑瘤率并绘制瘤生长曲线,HE染色观察瘤组织细胞形态变化,Western Blot检测瘤组织凋亡蛋白和PI3K/Akt信号通路蛋白变化。实验研究结果显示:在体外,Nef处理Hela细胞24小时后,光学显微镜下观察细胞形态,细胞逐渐失去正常形态,细胞变圆,贴壁能力降低,单个凋亡的细胞与周围的细胞分离,透光性增加。CCK-8结果显示,Nef处理宫颈癌Hela细胞后,细胞活性降低,表明Nef能抑制Hela细胞增殖,呈现时间-剂量依赖性（P＜0.05）。荧光显微镜下TUNEL检测细胞凋亡数、流式细胞仪检测细胞凋亡率均有统计学意义（P＜0.05）;BAX、c-Caspase-3蛋白随Nef浓度增加表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量随之降低;p-PI3K、p-Akt蛋白表达随Nef浓度增高逐渐降低;以上指标实验组分别与对照组(Nef浓度为0μg·ml-1)相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;PI3K、Akt的蛋白相对表达量无统计学意义。在体内,与对照组（生理盐水）相比,Nef可使移植瘤细胞体积和肿瘤显著降低（P＜0.05）。HE染色后镜下可见Nef处理组组织细胞比对照组排列疏松,细胞体积缩小,核浆比例缩小,细胞间隙增大甚至出现纤维条索样组织。此外,与对照组相比,Nef能抑制移植瘤细胞Bcl-2表达,促进BAX蛋白表达,激活Caspase-3蛋白表达从而抑制细胞增殖（P＜0.05）;同样,p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著降低（P＜0.05）,而各组中PI3K、Akt蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。综上所述,Nef可促进宫颈癌Hela细胞凋亡,其机制是通过抑制PI3K/Akt信号通路发生作用的。
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