研究背景动脉粥样硬化（AS）是一种动脉壁的慢性炎性疾病。动脉粥样硬化斑块不断进展形成的易损斑块,具有大的脂质核心、薄的纤维帽和明显的巨噬细胞浸润,是导致大多数急性冠脉事件的根本原因。稳定易损斑块是改善动脉粥样硬化患者预后的重中之重。炎症是动脉粥样硬化易损斑块发生发展的重要机制之一,然而目前,临床对易损斑块的治疗手段主要停留在了降脂层面,尚未有针对性治疗炎症的药物。NLRP3炎症小体是炎症反应中的重要因子。NLRP3的激活,伴随下游caspase-1、IL-1β和IL-18等炎性因子的激活。抑制NLRP3炎症通路对于减轻炎症反应、稳定易损斑块至关重要。中药通心络（TXL）具有扩张血管、保护血管内皮等的作用,已被国家食品药品监督管理局批准用于治疗心绞痛和缺血性中风等心血管疾病,其临床有效性和安全性也已被很好的验证。有研究发现,TXL干预后ApoE-/-小鼠动脉斑块负荷减少,斑块易损性降低。但是,TXL稳定易损斑块的机制仍不清楚。TXL能否通过抑制NLRP3炎症通路来减轻炎症反应,有待进一步的研究。近年来,研究发现肠道菌群与疾病之间存在着不可忽视的联系。肠道菌群能调控宿主体内多种代谢稳态,菌群失调也会进一步影响疾病的发生发展。目前,易损斑块与肠道菌群之间的关系尚未有研究,需要我们进一步的探索。中草药等药物的代谢及作用发挥均离不开肠道菌群的作用,TXL能否影响易损斑块兔模型的肠道菌群?TXL稳定易损斑块的作用是否与肠道菌群也存在着极大的联系?值得我们进一步探索。研究目的1.探索高胆固醇饮食和球囊损伤（HCB）诱导的动脉粥样硬化易损斑块模型中肠道菌群及代谢物的改变;2.探讨在动脉易损斑块模型中,通心络干预对易损斑块的影响,及通心络对肠道菌群和肠道代谢物的影响;3.探讨通心络是否通过改变肠道菌群及代谢物而抑制血管斑块内的炎症反应,从而发挥稳定动脉易损斑块的作用。研究方法选用1.5kg左右的新西兰大白兔62只。将新西兰兔随机分为对照组（CONTROL组,n=12）和实验组（n=50）。实验组兔采用高胆固醇饮食和球囊拉伤技术（HCB）建立动脉粥样硬化易损斑块模型。将术后的新西兰兔随机分为HCB组、通心络干预4周组（HCB+TXL4w）、8 周组（HCB+TXL8w）和 12 周组（HCB+TXL12w）。ELISA 法检测血清中IL-1β、TNF-α的浓度。酶联免疫法检测血清中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和甘油三酯（TG）的浓度。HE染色观察不同组间血管形态差异;Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测兔血管的纤维化情况;血管的大体标本和冰冻切片油红O染色,观察不同组间斑块情况和脂质含量的差异。采用IHC、RT-PCR及Western blot法检测血管中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的定位及在mRNA水平和蛋白水平的表达差异。16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学测序分析肠道菌群的组成及肠道代谢物的差异。统计学分析数据用平均值±标准误或中位数（最小到最大）表示。p＜0.05或adjustedp＜0.05被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。研究结果1.HCB明显促进动脉易损斑块形成,并激活NLRP3炎症通路,增强炎症反应HCB 组的兔的血清中 TG（2.95±0.59 mmol/l）、TC（31.06±2.77 mmol/l）和 LDL-C（10.57±1.6 mmol/l）的含量比 CONTROL 组 TG（0.65±0.16 mmol/l）、TC（0.93±0.18 mmol/l）和LDL-C（0.1±0.04 mmol/l）的含量明显增加,而HDL-C含量无明显变化（HCB组0.65±0.09 mmol/l、CONTROL组0.65±0.10 mmol/l）。胸腹主动脉的内膜可见明显的斑块破裂及血栓存在,大体油红O染色也显示大面积的脂质存在及大量的斑块形成,腹主动脉切片染色可观察到明显的薄纤维帽斑块的存在。同时,与CONTROL组TNF-α的浓度（202.8±10.51 pg/ml）相比,HCB 组 TNF-α 的浓度（236.1±8.1 pg/ml）明显升高。与 CONTROL 组 IL-1β 的浓度（33.03±1.55 pg/ml）相比,HCB 组 IL-1β 的浓度（43.35±1.82 pg/ml）也明显升高。HCB组血管中NLRP3及其下游的caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA及蛋白的表达水平均显著增高,而且定位分析显示这些炎症因子主要在血管的斑块中表达,尤其是易损斑块中,这些因子的表达量极高。2.HCB诱导的兔易损斑块模型中,肠道菌群组成及肠道代谢谱发生明显改变研究发现,与CONTROL组相比,HCB组拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著降低,厚壁菌门（Firmicutes）的丰度升高,Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值明显升高,兔的肠道菌群组成出现明显差异,菌群比例严重失调。HCB显著增加了许多肠道细菌之间的负相关性,特别是拟杆菌门和厚壁菌门,菌群间的共生关系产生明显紊乱。在菌属和菌种水平上,HCB 使 Succinispira,mobilis,Alistipes,indistinctus,Campylobacte、Odoribacte,subantarcticus 等菌相对丰度显著减少,而 Akkermansia,islandicul,Desulfovibrio等菌相对丰度显著增多。非靶向代谢组学测序分析结果显示:HCB组与CONTROL组比较,许多氨基酸衍生物、胆汁酸、碳水化合物、脂质、脂肪酸、酚类等肠道代谢产物含量发生明显变化。如 N-Acetylputrescine、cis-（Homo）3-aconitate、Cholic acid、Tulipalin B、4-Hydroxyphenylethanol 等显著增多,而 Pidolic acid、Nitrilotriacetic acid、4-Methylene-L-glutamine、5,10-Methylenetetrahydrofolate＞16-Feruloyloxypalmitate 等显著减少。Spearman相关性分析显示,多种差异代谢物与差异菌和炎症因子、血脂之间存在明显的相关性。如,代谢产物中5,10-亚甲基四氢叶酸与IL-1β呈显着负相关,而cis-（Homo）3-aconitate 与 IL-1β 显着正相关。一些差异细菌,如Alistipes、indisintinctus、intestinihominis和Succinispira mobilis等,也与许多代谢物存在着明显的相关性。3.TXL通过非血脂依赖性途径稳定动脉易损斑块,并抑制NLRP3炎症通路,减轻炎症反应计算斑块易损指数:（巨噬细胞%+脂质%）/（SMC%+胶原纤维%）。结果显示,与HCB组相比,经TXL治疗12周的家兔腹主动脉斑块易损指数明显降低。有趣的是,TXL干预组并没有降低血清TG、TC、LDL-C的含量,对HDL-C也无显著影响。相反,TXL干预12周显著降低了血清TNF-α的浓度（192.9±14.7 pg/ml）。说明TXL减轻了机体的炎症反应。为进一步明确TXL抑制炎症反应的具体机制,我们进行Western Blot和免疫组化检测血管组织中NLRP3相关的炎症因子的表达。结果显示,经TXL干预后,NLRP3、caspase1、IL-1β和IL-18四种炎症因子在斑块内的表达显著降低。4.TXL通过改变肠道菌群及肠道代谢谱稳定易损斑块研究发现,HCB+TXL12w组与HCB组相比,兔的肠道菌群组成及结构发生了明显的改变。冗余分析和典范对应分析分析均显示,两组兔的肠道菌群明显分离。HCB+TXL12w组拟杆菌门的相对丰度明显升高,F/B值明显降低。此外,HCB+TXL12w组的Alistipes、indistinctus、Campylobacter、Rikenella等菌属或菌种相对丰度增加,而Ruminococcus,albus等相对丰度减低。相关性分析显示,在TXL干预后,HCB显著增加的拟杆菌门和厚壁菌门之间的负相关性减弱甚至消失。说明TXL在一定程度上改善了菌群失调。非靶向代谢组学分析显示,与HCB组相比,TXL干预12周组的肠道代谢物发生明显改变,许多代谢物是由肠道细菌直接产生或调节的。其中,DL-3-Phenyllactic acid、Nitrilotriacetic acid、Hydroxyphenyllactic acid、trans-Ferulic acid（TFA）等与易损指数存在着明显负相关性。5.TXL通过增加肠道细菌Alistipes indistinctus及肠道中代谢物TFA抑制NLRP3炎症通路在TXL改变的菌群与代谢物中,菌种indistinctus和代谢物TFA的变化尤为明显,可能是TXL发挥稳定易损斑块的潜在的机制。所以,我们在ApoE-/-小鼠体内对Alistipes菌属中的indistinctus菌的作用进行了进一步的研究,发现indistinctus对普通饮食的小鼠血管的NLRP3炎症通路蛋白表达无显著影响,但能明显抑制高脂喂养小鼠血管中的NLRP3炎症通路。同时,研究发现,高温灭活的indistinctus并没有发挥抑制NLRP3炎症通路的作用。说明活性形式的indistinctus对抑制炎症反应至关重要。对差异代谢物TFA的进一步研究也发现,TFA可以抑制巨噬细胞中NLRP3及下游炎症因子caspase-1、IL-1β和IL-18的表达。结论1.高胆固醇饮食和球囊损伤（HCB）明显促进了兔动脉粥样硬化易损斑块的形成,增强了炎症反应;HCB诱导的易损斑块模型中,肠道菌群及代谢物发生明显改变,F/B比值明显升高,Succinispira,Alistipes,Campylobacte等菌显著减少,而Akkermansia,Desulfovibrio等菌显著增多;2.在易损斑块模型中,通心络抑制了血管NLRP3炎症通路;明显改善了肠道菌群失调,降低了 F/B值,增加了Alistipes等菌的含量,改变了肠道菌群组成;明显增加了肠道反式阿魏酸等多种有益代谢物的含量;3.TXL可以通过增加肠道中活性形式的indistinctus菌,以及增加肠道中代谢物TFA的含量进而抑制血管中NLRP3炎症通路,发挥稳定易损斑块的作用。