肺腺癌（Lungdenocarcinoma,LAD）是最常见的肺癌类型,在不吸烟人群中发病率更高。研究表明LAD在男性中的发生率稳定,但在女性中仍在增加,由于性别差异,性激素被认为在肺腺癌的发生中起着重要作用,既往多项研究亦表明女性肺腺癌与性激素水平相关。现代医学与中医学相结合的研究指出“下丘脑-垂体-性腺轴”可视为肾的本质之一,肾虚证患者通常存在下丘脑-垂体-性腺轴不同程度的功能紊乱,肾气盈亏与性激素水平密切相关。根据性激素在女性肺腺癌发生发展中的重要作用,从中医学角度认识两者关系认为肾虚与女性肺腺癌可能存在一定的相关性。中医药疗法以其独特的整体观念在改善患者症状、增强疗效、降低毒副作用、提高生存质量及延长患者生存期方面具有明显优势,近年来在癌症治疗中广泛应用。结合肺腺癌患者的临床特点,多位医家采用补肾培元、益气温阳化湿等法取得了良好的临床效果,其中名方阳和汤在肺癌的临床研究中得到了广泛的应用。目前多项研究已阐述了阳和汤在乳腺癌治疗中的作用机制,但在肺腺癌中尚欠缺大量且深入的基础研究,需进一步探讨以为其临床应用提供理论依据。因此,本课题致力于研究女性肺腺癌的中医证素分布规律及特点,并在补肾温阳指导下选用阳和汤为基础方,结合导师多年用药经验组阳和汤加味方剂,通过实验研究观察其对肺腺癌的抑制作用并进一步探讨其作用机制。研究内容主要分为以下两部分:一、临床研究通过对女性肺腺癌患者中医四诊信息进行统计分析,总结女性肺腺癌患者证候表现,探讨其中医证素的分布规律及特点,以及与年龄、吸烟史、家族史、绝经年龄、激素水平、临床分期等因素的相关性。二、实验研究通过体外实验观察阳和汤加味方剂对肺腺癌细胞的抑制作用;构建雌性裸鼠肾虚证肺腺癌移植瘤动物模型,通过体内实验观察阳和汤加味对移植瘤的抑制作用;结合网络药理学预测其分子作用机制,并进行实验验证其调控机制。第一部分女性肺腺癌患者中医证素分布规律的临床研究研究目的1.探讨女性肺腺癌患者中医证素的分布规律及特点;2.统计分析女性肺腺癌患者年龄、吸烟史、家族史、绝经年龄、激素水平、临床分期与证素的关系。研究内容和方法收集2020年6月~2021年10月就诊于山东省中医院、青岛市海慈医疗集团共120例女性肺腺癌患者资料,建立数据库,运用统计软件对数据进行归纳分析。证素统计方法参考朱文锋《证素辨证学》中的“简化计量”方法进行证素判别。首先将收集到的症状、体征等病情资料,对比《证素辨证学》的证素分别进行加权求和,得出各证素的总权值,据此判断出证素属性。对患者相关症状、体征对各证素贡献度的得分情况进行统计,按相应证素诊断标准诊断相应证素,然后在SPSS 22.0统计软件中对所诊断的证素进行频数和频率的统计分析。研究结果1.纳入的患者年龄分布以50~59岁、60~69岁人数最多,既往无吸烟史患者占比高达97.5%。有家族史患者占总人数的19.2%,类型由多到少依次为肺癌、胃癌、食道癌、大肠癌。绝经年龄多数患者在50~53岁年龄段,占比49.2%,尚未绝经者占比较少。TNM分期中I期、IV期最多,分别占总人数的35.8%、31.7%。2.女性肺腺癌患者病位证素以肺为主,其次为脾和肾;病性证素中以气虚出现频率最高,其次是痰、阳虚、湿、热（火）,血瘀、血虚证素出现次数相对较少。3.病位证素的组合形式以两证素多见,占比达46.7%,主要为肺+脾、肺+肾,三证素多表现为肺+脾+肾。病性证素组合形式中,单一病性证素以痰、气虚、阳虚、饮、气滞出现频次较高;两病性证素组合中,气虚、痰、湿、阳虚、热（火）两两组合的相对较多。4.年龄与病性证素的关系中,≤49岁患者的病性证素主要为痰、气滞、热（火）;50~59及60~69岁年龄段主要病性证素均是气虚、痰、阳虚;≥70岁的患者病性证素分布较为分散。5.临床分期方面,I期患者病性证素痰、湿多见,其次为气虚、阳虚、热（火）、气滞;II期患者中常见者为痰、气虚、饮、气滞;III期患者气虚、阳虚、湿、饮分布较均匀,IV期患者气虚、阳虚、痰、热（火）、阴虚病性证素多见。6.女性性激素水平与病性证素的相关性中,病性证素阳虚患者的雌激素水平明显低于其他常见证素,差异具有统计学意义（P＜0.05）,而睾酮水平与其他证素无统计学差异。结论女性肺腺癌的高发年龄为50~69岁,大多数在绝经后,随着诊疗水平的提高,确诊时处于早期的患者比例较多。患者病位证素多在肺、脾、肾;病性证素多为气虚、痰、阳虚、湿、热（火）,组合形式中单一证素和两证素占比较大的证素均有痰、气虚、阳虚。高发年龄阶段的病性证素主要为气虚、痰、阳虚。临床分期中早期多为痰湿等实证,中晚期病性证素则表现为气虚、阳虚、痰、湿、热（火）等虚实夹杂。病性证素阳虚患者的雌激素水平低于其他常见证素,睾酮含量无明显差异。第二部分实验研究研究目的1.观察阳和汤加味含药血清对人肺腺癌细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响。2.研究阳和汤加味含药血清干预人肺腺癌细胞的分子调控机制。3.观察阳和汤加味方剂对雌性裸鼠肾虚证肺腺癌移植瘤生长的影响及机制验证。研究内容和方法1.获得人肺腺癌A549、H1975细胞株,制备阳和汤加味含药血清,设立空白组、阳和汤加味低、中、高剂量组,通过CCK8、平板克隆实验检测各组细胞生长和增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,划痕实验检测迁移能力,transwell实验评价侵袭能力。2.结合网络药理学,预测阳和汤加味方剂干预肺腺癌的分子调控靶点和通路,通过q PCR和Western blot检测肺腺癌细胞株中关键因子miR-1-3p、PI3K、AKT、m TOR的m RNA和蛋白表达水平。3.使用miR-1-3p过表达及敲降的慢病毒转染肺腺癌细胞（A549、H1975）,应用q PCR确认转染效率,建立过表达及敲降稳定转染细胞株。通过Western blot检测miR-1-3p过表达及非过表达细胞株预测通路中PI3K、AKT、m TOR蛋白的表达变化。为确认miR-1-3p是否影响阳和汤加味含药血清对肺腺癌的调控作用,检测miR-1-3p敲降是否可以逆转阳和汤加味含药血清对肺腺癌细胞的抑制作用。4.体内实验中,给予雌性裸鼠双侧卵巢切除+肺腺癌H1975细胞株原位种植,建立肾虚证肺腺癌移植瘤动物模型,设立空白组、肾虚组、病模组、肾虚病证组、阳和汤加味组。描绘体重、肿瘤生长曲线,Western blot、q PCR检测各组肿瘤组织miR-1-3p、PI3K、AKT、m TOR的m RNA及蛋白表达水平,病理学检测及免疫组化评估肿瘤组织的组间差异。研究结果1.阳和汤加味含药血清抑制肺腺癌细胞的生长、增殖;促进肺腺癌细胞的凋亡,并可调控凋亡相关蛋白的表达;同时可降低肺腺癌细胞的迁移及侵袭能力。2.分子调控预测结果表明,阳和汤加味方剂和miR-1-3p均可调控PI3K/AKT/m TOR信号通路。实验表明阳和汤加味含药血清可提高肺腺癌细胞株miR-1-3p表达水平,降低肺腺癌细胞PI3K/AKT/m TOR信号通路m RNA及蛋白的表达。而miR-1-3p下调可阻断阳和汤加味含药血清对肺腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响,并逆转通路蛋白的表达情况,阳和汤加味含药血清通过调控miR-1-3p抑制肺腺癌细胞PI3K/AKT/m TOR信号通路。3.体内实验显示,肾虚病证组瘤组织的生长速度及程度较病模组明显,阳和汤加味方剂可抑制体内移植瘤的生长。HE染色镜下观,与病模组、肾虚病证组比较,阳和汤加味组瘤组织癌细胞胞浆淡然、少见核分裂、可见纤维素样坏死等现象;免疫组化结果显示,病模组、肾虚病证组中Ki67蛋白呈现高表达,阳和汤加味干预后Ki67阳性率明显低于前两组;TUNEL染色中病模组、病证组可见少量凋亡细胞,阳和汤加味干预组凋亡细胞明显增多。4.对比空白组、肾虚病证组、阳和汤加味组裸鼠ALT、AST、BUN、Cr血清含量显示各组均在正常范围,用药后裸鼠肝肾功能未见明显异常。肾虚病证组E2含量低于病模组,而给予阳和汤加味干预后E2含量明显升高。5.病模组miR-1-3p表达水平高于肾虚病证组,而PI3K、AKT、m TOR的表达量低于肾虚病证组;阳和汤加味组miR-1-3p表达水平较肾虚病证组显著提高,且通路相关蛋白表达量明显下降。结论体外实验中,阳和汤加味含药血清可通过调控miR-1-3p进而影响下游PI3K/AKT/m TOR信号通路以抑制肺腺癌细胞的生长、增殖,促进肺腺癌细胞的凋亡,并降低肺腺癌细胞的迁移及侵袭能力。体内实验中,肾虚病证组瘤组织的生长速度及程度较病模组明显,两组q PCR及Western blot检测m RNA及蛋白的表达量具有统计学差异,提示肾虚在一定程度上加剧了肺腺癌移植瘤的增长。阳和汤加味方剂可抑制雌性裸鼠肾虚证肺腺癌移植瘤的生长,降低增值指数Ki67蛋白的表达,并促进瘤组织细胞凋亡,改善肾虚证雌性裸鼠的E2水平。同样检测瘤组织中调控相关因子显示阳和汤加味方剂可升高miR-1-3p的表达水平,抑制PI3K/AKT/m TOR通路的活化。本课题临床与实验研究相结合可见,女性肺腺癌患者中医证素多见气虚、痰、阳虚、湿,在补肾温阳、益气化痰湿治法指导下的阳和汤加味方剂可以对女性肺腺癌的发生发展起到一定的抑制作用,其机制与调控miR-1-3p进而影响PI3K/AKT/m TOR信号通路相关。