【摘 要】
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马铃薯属于双子叶茄科植物,是世界上第三大粮食作物。自然界中主要有9种病毒对世界马铃薯生产造成重大影响。在本研究中,我们研究了外显子编码的人工微小核酸（ASEE）和内含子编码的人工微小核酸（ASEI）两种方法来对抗6种最为常见的马铃薯病毒,包括马铃薯病毒A,S,M,X,Y和马铃薯卷叶病毒。我们针对每种病毒设计了4到5个人工微小核酸（AMIR）,构建了两个包含25个AMIR的超级人工微小核酸簇（ASE
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马铃薯属于双子叶茄科植物,是世界上第三大粮食作物。自然界中主要有9种病毒对世界马铃薯生产造成重大影响。在本研究中,我们研究了外显子编码的人工微小核酸（ASEE）和内含子编码的人工微小核酸（ASEI）两种方法来对抗6种最为常见的马铃薯病毒,包括马铃薯病毒A,S,M,X,Y和马铃薯卷叶病毒。我们针对每种病毒设计了4到5个人工微小核酸（AMIR）,构建了两个包含25个AMIR的超级人工微小核酸簇（ASEE-S94和ASEI-L94）。首先我们在本氏烟草中通过瞬时表达方法验证ASEE-S94和ASEI-L94两种载体是否成功表达我们所设计的AMIR,结果表明两种载体表达的AMIR都能有效的抑制含有相应靶点的绿色荧光报告基因的表达,证明两种方法都成功的表达了我们所设计的AMIR。我们进一步用ASEE-S94和ASEI-L94构建了稳定的栽培烟草转基因株系,然后通过含有AMIR靶点的绿色荧光报告基因的瞬时表达证实了稳定转基因株系中各个AMIR也成功表达并有效的抑制了报告基因的表达。我们进一步通过小RNA测序和生物信息学分析发现了在ASEE-S94和ASEI-L94样品中我们设计的成熟人工微小核酸都准确高效的表达了,但是在ASEE-S94样品中检测到了部分来自于转录本负链的小RNA而ASEI-L94中则很少检测到这种小RNA,表明内含子编码的AMIR有更高的特异性表达。为了进一步验证AMIR在马铃薯中的抗病毒功能,我们用ASEE-S68（含有抗马铃薯卷叶病毒的AMIR）创建了转基因马铃薯。通过嫁接侵染实验我们筛选到了ASEE-S68-12和ASEE-S68-25两个系具有优良的抗性,其在接种后没有表现出卷叶症状而野生型的受体植株则表现出明显的症状。酶联免疫测试和反转录定量PCR也表明抗性植株中病毒外壳蛋白和RNA水平较对照显著降低。我们继续观察比较了抗性植株和对照植株块茎萌发的第二代植株,发现对照的第二代植株仍然表现出明显的卷叶症状而抗性植株的第二代植株叶片仍然健康。我们的研究显示出AMIR在防治马铃薯主要病毒病害和防止种薯退化方面可以发挥重要的作用。
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