福建省布鲁氏菌分离株MLST分型及应用重组抗原进行血清学检测的研究

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目的:利用传统生物学方法与MLST对福建省布鲁氏菌分离株进行分型研究,探索福建省布鲁氏菌菌株遗传进化关系,通过布鲁氏菌的分子流行病学研究,为布病防控策略的制定提供一定的科学依据;筛选布鲁氏菌病诊断抗原,建立间接ELISA检测方法并评价其检测灵敏度与特异度,为布鲁氏菌病血清学诊断方法奠定基础。方法:1.通过传统生物学鉴定方法与MLST对福建省布鲁氏菌菌株进行分型鉴定,其中MLST分型选用布鲁氏菌7个管家基因(aroA、cobQ、dnaK、gap、glk、gyrB、trpE)、1个基因间区(int-hyp)和1个外膜蛋白基因(omp25)的序列进行研究,对布鲁氏菌分离株的不同基因位点进行序列扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,确定获得特异性目标条带后送测序,采用MLST在线分析工具确定其等位基因型与ST型。通过MEGA5.0绘制等位基因进化树,通过Bionumerics6.6软件绘制最小生成树(MST)进行聚类分析。2.挑选布鲁氏菌免疫相关因子,经NCBI网站获取基因序列,PCR扩增目标片段转入T-A克隆载体;选择亲水性好的截短基因片段连接表达载体并转化大肠杆菌,诱导表达的重组蛋白经western blot鉴定其免疫反应性后,采用电洗脱法纯化;以重组蛋白为抗原,建立间接ELISA方法检测布鲁氏菌抗体,以SAT作为对照,评价其灵敏度与特异度。结果:1.50株布鲁氏菌分离株来源于福建省各设区市,传统生物学鉴定显示45株为羊种3型,5株为猪种3型;MLST鉴定显示44株为ST8型,5株为ST17型,其余1株为新的ST型:ST99,其gap基因与目前已报道的等位基因型不同,被定义为一个新的等位基因型gap(32)。MST图显示福建省与内蒙古、广东省、青海省共享ST8型。2.成功构建布鲁氏菌omp10、virb12、bp26、omp31基因的克隆表达载体并诱导表达目标蛋白,Western Blot试验证明了全长BP26重组蛋白与截短OMP31重组蛋白具有良好的免疫反应性,但OMP31重组蛋白不能有效区分布病阳性与阴性血清。以BP26重组蛋白为抗原的间接ELISA试验具有稳定、特异与灵敏的特点,以SAT试验为参照,其检测灵敏度为82.7%、特异度为95.0%,符合率达到91.2%。结论:1.MLST分型研究表明福建省布鲁氏菌菌株由ST8、ST17与ST99型构成,主要流行株为ST8型;其中ST99型为首次报告的基因型,尚未见其他地区报道该型别。2.福建省与内蒙古、广东省、青海省共享ST8型,提示福建省与上述布病重点省份之间可能存在病畜流通,需加强相关检疫监管力度。3.以BP26重组蛋白为抗原的间接ELSIA试验,与SAT的符合率达到91.2%,表明BP26蛋白在人布病诊断方面具有一定的潜力,可以作为人布病诊断的候选抗原。
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