遗传性FXII缺陷症(congenital FXII deficiency)最早由Ratnoff等于1955年报道,并以该患者的名字命名所缺乏的因子为Hageman因子,该患者无出血,仅检测到APTT延长,最终死于肺栓塞。后来研究发现该病为常染色体隐性遗传,部分呈常染色体显性遗传,男女均可发病[1-2],是一种罕见的凝血因子缺陷症。患者多数是在外科手术前的检查中因APTT延长而被偶然发现的[2-3],因此,该病在人群中的发病率还不十分清楚。关于其与血栓之间的关系,目前存在两种不同的观点,但是普遍认为FXII缺乏不会引起出血,而很可能是导致血栓形成的一个遗传性危险因素,陆续有病例报道,在一些血栓病患者中存在FXII缺乏。传统的检测方法对FXII缺乏仅能从表型上给予诊断,尚不够深入。近年来,随着分子生物学技术的发展和应用,人们开始对FXII缺陷症患者从基因水平上进行研究。 近年研究发现FXII基因1号外显子(exon 1)存在46C/T多态性(poly-morphism),该多态性与东方人血浆FXII活性水平降低有关。到目前为止已经发现了10余种突变(mutation),包括错义突变、启动子和剪接突变等,研究表明导致FXII缺乏的基因突变主要是单个碱基改变引起的错义突变。随着研究的深入,有关遗传性FXII缺陷症的报道逐渐增多,新的突变也不断被发现,且亚洲人的发病率明显高于欧洲人。依赖既往传统的实验室检查方法只能从表型上予以诊断,尚不够深入,且FXII缺乏与血栓性疾病的的关系尚存在争论,因此有必要采用基因分析的方法进一步探讨FXII缺乏的分子机制。 目的： 1.检测FXII的基因结构,找出基因突变的确切位点。 2.对遗传性FXII缺陷的患者家系成员进行基因分析,作出基因诊断。 3.为遗传性FXII缺陷的患者的临床干预和治疗提供参考,从而预防其发生血栓栓塞性疾病。 4.初步探讨遗传性FXII缺乏与血栓形成之间的关系. 材料与方法： 1 材料 1.1 标本来源本实验全部为外周静脉血样本,相关家系成员共12例,符合以下标准:APTT延长、FXII:C降低,排除其他凝血因子缺乏,排除慢性肝病、叶酸缺乏、感染等获得性因素。 1.2 标本采集采集相关家系成员外周静脉血4ml,用129 mmol/L柠檬酸钠按1:9抗凝,4000r/min离心15min,收集乏血小板血浆,立即进行凝血指标和因子活性的测定。 2.方法 2.1 血浆凝血功能的检测APTT、PT、FXII:C检测均采用法国STAGO公司试剂盒,采用STA-Compact全自动血凝仪(STAGO公司产品)测定,所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。 2.2 基因组DNA的提取(试剂盒法)分别加入细胞裂解液和细胞核裂解液以裂解红细胞及白细胞,再用蛋白沉淀剂去除蛋白,加入异丙醇,高速离心后再用70％乙醇处理,吸去乙醇风干DNA,加入DNA水化液(Rehydration Solution)于管中,4℃过夜以水化DNA。 2.3 PCR扩增所有DNA进行聚合酶链反应扩增,经变性、退火、延伸,共循环30次,取5μl产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2.4 PCR产物纯化用3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒,严格按照说明书进行。 2.5 PCR产物纯化后测序分析采用双脱氧链终止法在ABI377测序仪上进行测序,用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库(gene bank)所公布的FXII基因序列(GeneBankAF538691)进行比对(Blaster),寻找基因突变,发现基因突变的序列则反向测序予以证实。 结果： 家系1：先证者的FXII基因中1号外显子第46位核苷酸存在C/T多态性,为T/T型,4号外显子还存在3774位核苷酸G→C的杂合突变,导致氨基酸改变C(Cys)73S(Ser),先证者FxII:C为25％的儿子与先证者FXII基因型相同,其余女儿、儿子FXII基因中也存在杂合型46C/T多态性,无3774G→C突变。家系2：所有FXII:C为0的成员均为FXII46C/T多态性纯合型,其他成员均为46C/T多态性的杂合型。此外,还在先证者FXII基因的第9号外显子和第10号外显子之间的内含子区域,发现第5459位碱基出现C→T纯合突变,也见于家系中所有FXII:C为0的成员,其他家系成员为C5459T的杂合子。 结论： 1.2 个家系中所有FXII活性降低的成员均存在46C/T多态性,提示该多态性可能与遗传性凝血因子FXII缺陷症患者血浆中FXII活性降低相关。 2.家系1先证者为46C/T多态性纯合型,同时存在G3774C杂合突变,与其中一个儿子的基因型完全相同,但表型却不相同,其原因尚不明确。 3.家系1先证者存在G3774C杂合突变,反复发生血栓栓塞事件,但与其基因型完全相同的儿子却未曾发生过血栓形成,由于该突变为新发现的,其具体作用以及与血栓形成的关系尚不明确,还需要更深入的研究证实。 4.家系1的先证者和家系2中所有FXII活性为0的成员均存在纯合型46C/T多态性位点,只有家系1的先证者发生血栓事件,而其本身患有易导致血栓形成的疾病,故尚不能认为46T/T能增加血栓形成的风险,需要进一步的研究。 5.家系2先证者及所有FXII活性为0的成员均有C5459T纯合突变,该突变位于FXII基因第9号和第10号外显子之间的内含子区域,作用还不明确,尚不能认为其与FXII活性降低相关,推测在该家系可能还存在FXII基因内的大片段缺失,与46T纯合多态性、C5459T纯合突变共同作用,致使先证者与其母亲、哥哥、妹妹的FXII活性为0,还应对先证者的mRNA进行FXIIcDNA的扩增以证实是否存在缺失。