作为一类食源性病原菌，肠出血型大肠埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）感染宿主后，既可以释放一些毒素，如志贺毒素，又可以紧密地黏附在宿主的肠粘膜上，并由III型分泌系统（T3SS）的介导，将肠上皮细胞膜穿孔，损坏微绒毛结构，造成黏附与擦拭（Attaching and Effacing，A/E）损伤。这些过程都可导致严重的感染症状，如腹痛、腹泻，出血性肠炎，进而引起溶血性尿毒综合征甚至死亡。包括T3SS在内的多种分泌系统，存在于诸多革兰阴性病原菌中。这些分泌系统通过在细菌的膜上组装出跨膜运输通道，将行使不同功能的特异性底物转运出胞外，来完成各种生物学过程。　　在革兰阴性细菌中普遍存在的Hcp（溶血素共调节蛋白）不含信号肽，却又被外向分泌。研究表明，作为新型分泌系统，VI型分泌系统（T6SS）负责特异性转运该蛋白。在如霍乱弧菌等诸多病原菌中，将T6SS或者hcp敲除，均可导致相应的突变株毒力减弱。而铜绿假单胞菌可凭借由T6SS介导的抗细菌生长能力，在自然环境中获得生存优势。作为毒力因子等的分泌通路，T6SS对于病原菌致病性的作用和意义仍需深入研究。　　为了从T6SS的角度，更深入地阐明EHEC的致病机制，我们以O157:H7型EHEC的参考菌株EDL933为研究对象，通过相似性比对，在其基因组上的毒力岛（O-island）上发现了T6SS的典型编码基因簇，找到了约13个核心组分的编码基因。随后，我们界定出该基因簇的具体范围，从z0243到z0275，含32个ORF，全长为36.5 kb。在主要基因簇外还另发现z0706和z0707分别为hcp和vgrG的同源基因。我们通过构建动物模型和细胞模型，结合细菌学实验，从多方面阐述了T6SS的生物学特征，并总结出T6SS与EHEC致病性的关系，包括：　　1、利用λRed同源重组法构建了ΔT6SS，研究发现，ΔT6SS在生长速率、迁移能力等的方面相比于野生型（WT）并无明显不同。随后，通过LC-MS/MS检测WT与ΔT6SS的分泌蛋白组分并加以对比分析和实验验证，我们鉴定到T6SS新的底物：Z1921。通过详细地生理生化检测，我们发现，Z1921（以后命名为KatN）为Mn-过氧化氢酶，可分解H2O2，有助于细菌耐受由H2O2引起的氧化应激。无论是否外加终浓度为1 mM的H2O2，在对数期，RpoS和OxyR都可正调控katN的转录，维持KatN在细胞内的含量。　　2、通过改变培养条件（如37℃、25℃、pH5.5、pH8.1和2%NaCl等）或更换培养基（如LB、M9CA和DMEM等），都不能将T6SS的活性再提高。然而H-NS可抑制由水平基因转移而获得的基因的转录。通过转录组测序，我们比较了Δhns和WT基因转录水平的差异，发现在Δhns中，有954个基因转录水平出现差异，其中78%的基因转录水平提高，包括T6SS的相关基因。该结果得到了定量PCR和Western blotting的证实。　　3、在以BALB/c为小鼠模型的感染实验中，我们发现被ΔT6SS感染后，小鼠的生存水平明显高于WT组，说明T6SS与EHEC对小鼠的毒力有关。相比于WT，在对数后期，Δhns的生长开始放缓，到平台期时，细菌密度也较低，提示其需要更多的资源来使更多基因得以表达。在Δhns的基础上，无论是否敲除T6SS编码基因簇或katN，细菌对小鼠的毒力没有明显改变。提示Δhns为高毒株。当被鼠巨噬细胞吞噬后，T6SS相关基因及katN的表达水平明显提高，而当敲除hns后，这种提高幅度更大。若在此基础上再敲除T6SS编码基因簇或katN，则细菌在巨噬细胞内几乎无法生长。这提示我们，当被鼠巨噬细胞吞噬后，EHEC通过激活T6SS来维持生存。同时，在被吞噬后，细菌的rpoS表达上调，说明此时细菌面临的氧化应激水平增高。　　综上所述，在感染小鼠时，T6SS与EHEC对小鼠毒力的发挥有关。特别在感染初期，当被鼠巨噬细胞吞噬后，EHEC可通过RpoS感知因“呼吸爆发”而增强的氧化应激（如H2O2浓度升高），提高katN的表达水平，随后KatN被T6SS转运出细菌胞外，来改善EHEC的生存环境，维持其在巨噬细胞内的生存。　　本课题的研究成果为EHEC致病机制的探索提供了新的视角，加深了对EHEC致病性的认识，为相关疾病的治疗，药物开发等，提供了新的方向。