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目的:Bevacizumab进行玻璃体腔内注射治疗眼内各种新生血管性疾病,目前已经成为眼科领域的新热点,有关报道(1,2,3)相继发表于世,患者的视功能均有不同程度恢复和提高,然而对于其远期疗效,目前各国学者还没有进行大量的长期随访和前瞻性随机临床研究。当一种药物应用于局部,我们应该了解其对靶部位不同组织有无潜在毒性影响,有关Bevacizumab对体外培养的猪视网膜色素上皮细胞生长的影响,国内外临床和基础研究较少。本实验通过体外培养猪RPE细胞来观察Bevacizumab对视网膜色素上皮细胞的影响。方法:1猪视网膜色素上皮细胞培养1.1摘取猪眼球,去除眼前节和视网膜神经层,用胰酶消化法培养猪原代RPE细胞。1.2把剥离下来的视网膜神经层以1000r/min-1离心5min,加少许培养液,轻吹,吸出上层悬浮的颜色较深的液体,接种于培养瓶中。1.3细胞鉴定:免疫荧光,透射电镜两种方法对RPE细胞进行鉴定。2 Bevacizumab对体外培养的猪视网膜色素上皮细胞毒性作用2.1把培养的第3代RPE细胞接种于96孔板中,分别加入终浓度为0,0.125,0.5,1.0,1.25,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分别于12h,24h,48h,72h后,MTT比色法测定药物对RPE增生的影响。2.2根据MTT结果,将培养的第3代细胞中加入终浓度为2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,培养72小时后,流式细胞术检测Bevacizumab对RPE细胞凋亡和细胞周期的影响。2.3第三代RPE细胞,加入终浓度为2.0mg/ml的bevacizumab作用72h后,透射电镜观察RPE细胞形态的改变。3 Bevacizumab对猪视网膜色素上皮(RPE)细胞吞噬和移行功能的影响3.1 ROS制备和FITC荧光标记,细胞色素的制备室温下,于暗处用终浓度为10ug/ml的FITC液孵育提取的ROS1小时,然后以细胞培养液调整浓度为l×107 /ml。原代细胞培养时,在第二次换液时,吸取培养瓶下部1/2培养液,用培养液稀释,-20℃冻存备用。3.2 RPE细胞的培养及标记采用胰蛋白酶消化法。把培养的第3代RPE细胞接种于24孔板中,分别加入终浓度为0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分别于12h,24h,48h,72h后,用含有终浓度为40ug/mlSR的生长液孵育RPE细胞36小时。3.3吞噬动力学观察向每个培养孔(24孔板)中加入l×107 /ml的FITC-ROS50ul,进行孵育24h。将孵育液吸出,以4℃的无血清DMEM冲洗二次,以终止吞噬。在荧光显微镜下观察吞噬量。3.4非特异性吞噬实验采用胰蛋白酶消化法,把培养至无色素的第7代RPE细胞接种于96孔板中,分别加入终浓度为0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab ,分别于12h,24h,48h,72h后,将培养液吸出,每孔加入含色素的培养液60ul,24h后洗净,用405nm波长的酶联免疫检测仪检测RPE吞噬色素量。3.5检测对RPE细胞移行能力的影响将培养的第3代RPE细胞以5×104个每孔接种于24孔细胞培养板上,分别加入终浓度为0,0.25,1.0,2.0,2.5mg/ml的Bevacizumab,分别于12h,24h,48h,72h后,将培养液吸出,制造RPE细胞损伤模型,无血清培养48h,HE染色,计数进入刮痕区的细胞数。结果:1.体外培养的猪原代RPE细胞生长良好,有的呈集落式生长,细胞呈不规则形,接近融合时近六边形,传代稳定,透射电镜表明细胞内含大量色素,免疫荧光鉴定抗角蛋白抗原阳性;2.通过MTT法检测,2.0-2.5mg/ml浓度范围内,与对照组比较,Bevacizumab作用72h后RPE细胞生长均有明显抑制(p<0.05),且呈浓度依赖性;3.流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Bevacizumab组S期细胞较对照组减少,细胞凋亡与对照组无差异;4.透射电子显微镜观察细胞的超微结构,Bevacizuman组细胞微绒毛减少,细胞质内出现空泡和髓鞘样变性;5.与对照组相比,Bevacizumab的任何浓度和任何时间段对RPE细胞的特异性吞噬和非特异性吞噬都没有影响;6. Bevacizumab在2.0-2.5mg/ml浓度范围内,与对照组比较,Bevacizumab作用48h后可明显抑制RPE细胞移行。结论:1.本研究成功的培养了猪原代RPE细胞,并最大化的收集了RPE细胞,细胞保持正常增殖能力,免疫荧光鉴定抗角蛋白抗原阳性,所采用方法与人RPE细胞培养相近,来源,取材不受限制,操作更方便,可以在某些方面代替人RPE细胞来进行实验方面的研究工作;2.在观察Bevacizumab对RPE细胞毒性的影响中,浓度达到2.0mg/ml时才表现出对RPE细胞增殖的影响;3.在Bevacizumab对RPE细胞功能的影响中,只有较高浓度的药物才对移行功能造成影响。实验证明贝伐单抗低浓度还是比较安全的。