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研究背景： 腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)由于具有操作简单、血流动力学稳定和有利于保护残肾功能等优点，因此被广泛运用于终末期肾脏疾病(end stage renal disease，ESRD)患者的治疗，然而PD的相关并发症影响着ESRD患者的治疗效果和预后，其中透析相关性腹膜纤维化(peritoneal fibrosis，PF)导致的超滤衰竭(ultrafiltration failure，UFF)是持续性非卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)患者不能持续治疗的主要原因。转化生长因子β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)和高糖介导的PF发病机制一直是国内外PD领域研究的热点，有研究发现，上皮细胞-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腹膜纤维化发生的过程中起着关键的作用，它被认为是腹膜纤维化的起始环节和可逆阶段。 微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是广泛存在于真核生物细胞中长度为21-24个核苷酸的非编码小分子RNA，其通过“种子”序列与靶基因mRNA3端非翻译区(untranslated region，UTR)特异性结合，导致蛋白翻译受到抑制或靶mRNA降解，从而影响调节转录后的基因表达，在多种生理过程中发挥重要作用。miRNA-200家族是近年来研究的热点，尤其miRNA-200家族与EMT密切相关，miRNA-200通过调控EMT过程，对胚胎的发育、肿瘤的侵袭转移及器官纤维化均起着重要作用。尽管miRNA-200c在腹膜间皮细胞上是否有表达以及其在腹膜间皮细胞EMT和腹膜纤维化中的作用国内外尚未见报道。但基于以上分析，我们认为，microRNA-200c可能参与了调控腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的过程，并且调节miRNA-200c的表达水平可能影响腹膜间皮细胞的EMT过程。 第一章，腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中microRNA-200c的表达及与转分化的关系 目的:检测腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中microRNA-200c的表达及EMT发生情况，初步探讨microRNA-200c与腹膜间皮细胞EMT的关系。 方法:随机选取新开管CAPD患者13人，PD时间≥1年者14人，分离培养并鉴定流出液细胞;通过realtime PCR检测流出液细胞中microRNA-200c的表达;利用realtime PCR及western blot分别检测流出液细胞中E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、胶原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ， Col-Ⅰ)的mRNA及蛋白表达。并对microRNA-200c与E-cadherin、vimentin、FN、Col-1进行相关性分析。 结果:腹透流出液细胞为人腹膜间皮细胞(human peritonealmesothelial cells，HPMC)，不同透龄患者流出液细胞存在形态学改变。microRNA-200c在PD≥1年组中的表达较新开管组明显下降。PD≥1年组流出液细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达明显低于新开管组，而vimentin、 Col-1及FN mRNA及蛋白表达明显高于新开管组。且microRNA-200c与E-cadherin呈正相关，与vimentin、FN、Col-Ⅰ呈负相关。 结论:腹膜透析患者腹透流出液细胞经证实为人HPMC，并表达microRNA-200c;随PD时间的延长，microRNA-200c表达呈显著降低并同时伴有EMT的发生和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沉积，提示microRNA-200c可能与腹膜纤维化有关。 第二章，microRNA-200c在高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT中的作用 目的:探讨microRNA-200c在高糖诱导的人腹膜间皮细胞株（HMrSV5）EMT中的作用。 方法:以含5.6mM葡萄糖的普通培养基作为对照组，HMrSV5细胞被给予不同浓度（30，60，90mM D-葡萄糖）高糖刺激，刺激时间为24小时，通过realtime PCR检测HMrSV5细胞microRNA-200c的表达;利用realtime PCR及western blot分别检测HMrSV5细胞中E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN mRNA及蛋白的表达。在不同时间点(0h，12h，24h，48h)用90mM D-葡萄糖处理HMrSV5细胞后，通过realtime PCR检测HMrSV5细胞microRNA-200c的表达;通过realtimePCR及western blot分别检测HMrSV5细胞中E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN mRNA及蛋白的表达。转染microRNA-200c的模拟物(mimics)及阴性对照miR-200c mimics negative control，再予高糖刺激，通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测HMrSV5细胞E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN的表达变化。 结果:与正常对照组相比较，高糖抑制HMrSV5细胞E-cadherinmRNA及蛋白表达水平，且呈时间及浓度依赖性;同时高糖促进vimentin、FN及Col-Ⅰ mRNA及蛋白表达水平，也呈时间及浓度依赖性。与正常对照组比较，高糖抑制HMrSV5细胞microRNA-200c表达，呈时间及浓度依赖性。过表达microRNA-200c可以使高糖刺激组E-cadherin mRNA和蛋白表达上调，vimentin、Col-Ⅰ、FN mRNA和蛋白表达下调;但转染miR-200c mimics negative control后对高糖诱导的HMrSV5细胞E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN的表达变化无明显影响。 结论:高糖诱导HMrSV5细胞发生EMT;高糖诱导HMrSV5细胞microRNA-200c表达下调;上调microRNA-200c可逆转HMrSV5细胞EMT，提示microRNA-200c抑制高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT。 第三章，microRNA-200c通过调节ZEB1参与高糖诱导的人腹膜间皮细胞转分化 目的:阐明microRNA-200c参与调控高糖诱导的HMrSV5细胞EMT的可能机制，为靶向microRNA-200c防治腹膜纤维化提供理论依据。 方法:采用realtime PCR及western blot检测不同透析时间PD患者腹膜透析流出液分离培养的HPMC中ZEBl mRNA及蛋白的表达;用不同浓度（30，60，90mM D-葡萄糖）高糖及在不同时间点(0h，12h，24h，48h)用90mM D-葡萄糖刺激HMrSV5细胞后，通过realtime PCR及western blot检测HMrSV5细胞中ZEB1的表达;转染microRNA-200cmimics及miR-200c mimics negative control后，通过细胞免疫荧光、realtime PCR及western blot检测高糖刺激下HMrSV5细胞ZEB1mRNA及蛋白表达变化。 结果:PD≥1年组与新开管组比较，腹膜透析流出液分离培养的HMPC中ZEB1的表达增高;与正常对照组比较，高糖促进HMrSV5细胞ZEB1 mRNA及蛋白表达，且呈时间和浓度依赖性上调。过表达microRNA-200c可以使ZEB1 mRNA和蛋白水平下调;转染miR-200cmimics negative control后对高糖诱导的HMrSV5细胞ZEB1的表达变化无明显影响。 结论:长期PD患者腹透流出液分离培养的HPMC ZEB1表达上调;高糖促进HMrSV5细胞ZEB1 mRNA及蛋白表达，miRNA-200c过表达抑制高糖组HMrSV5细胞中ZEB1的表达，提示miRNA-200c通过转录后水平调节ZEB1，影响E-cadherin等的表达，从而参与高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT。