腹泻病是全球疾病负担和危害的主要原因,5岁以下儿童因腹泻死亡人数每年超过800 000。腹泻主要是由细菌、病毒和寄生虫引起,大多数是通过食物传播。作为食源性病原菌,产肠毒素大肠杆菌（ETEC）引发的传染性腹泻在低收入国家是引起幼畜、婴幼儿高死亡率的传染性疾病之一。然而现有的抗生素治疗方法带来严峻的细菌耐药性问题,已引起科学家们的高度重视。针对易受感染的儿童和断奶仔猪,寻求高效、安全的抑制和干预ETEC的天然抗生素药物或膳食补充剂,则是目前重要的解决途径和主要策略。为此,本文基于实验室前期对原花青素和益生菌在肠道中的有益作用的研究及其相关积累,从体外、细胞、体内和分子水平证实了A-型荔枝原花青素（LSOPC）和B-型莲原花青（LSPC）及其组成单体对ETEC的抑菌和抗粘附效果,并对其抗腹泻的作用及机制进行了探讨。本研究的完成填补了B型原花青素与益生菌联用抗ETEC诱导腹泻作用研究的相关空白,为进一步开发莲房原花青素成为一种潜在的新型、天然的抗腹泻制剂和抑菌剂提供了实验和理论基础,具有重要的科学和实际意义。主要的研究结果如下:1.莲房原花青素对ETEC抑菌效果及其机制研究研究了A-型/B-型原花青素低聚体（LPOPC与LSPC）及其单体,以及与益生菌联用对三株ETEC菌株（K88ac、F18ac与K99）的抑菌效果和作用机制,同时还考察了它们对7种益生菌生长的影响。结果表明,LSPC、LPOPC与儿茶素对三株ETEC菌株均表现出较强的抑菌和杀菌作用,其抗菌作用与其结构密切相关,其中B-型原花青素LSPC＞儿茶素＞A-型原花青素LPOPC＞表儿茶素。同时,LSPC与LPOPC的抗菌活性还存在浓度依赖性。对于K88ac,LSPC与LPOPC分别在浓度高于0.8mg/m L、1.5 mg/m L时抑制K88ac生长,而在浓度较低时则显示出促生长作用。相反,益生菌对LSPC与LPOPC的耐受程度显著高于ETEC,LSPC在抑制K88ac生长的浓度下（0.8 mg/m L）能促进副干酪乳杆菌（LPC）、双歧杆菌（Bb-12）、鼠李糖乳杆菌（LGG）、植物乳杆菌（LP）和嗜热链球菌（ST）五种益生菌的生长,而LPOPC在K88ac的MIC浓度下仅能促进植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌三种益生菌的生长。二者相比,LSPC对益生菌显现出更好的促生长作用,在益生菌生长优势环境下,在较低浓度（0.125 mg/m L）时可显著增强植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌与鼠李糖乳杆菌对ETEC的杀菌能力。扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、流式细胞仪、荧光显微镜和K+浓度等测试结果表明LSPC主要通过与细菌作用引起细胞膜产生孔洞、破坏细胞膜结构完整性和通透性,导致细胞质组分泄漏,胞外K+浓度增加而导致细菌死亡。表明LSPC是一种优良的天然抑菌剂。2.原花青素与益生菌抑制ETEC在肠上皮细胞上黏附效果研究ETEC在小肠上黏附是引起腹泻的关键和必要条件,为此,本课题研究了A-型/B-型原花青素低聚体（LPOPC与LSPC）与不同益生菌单独及两者相互作用对抑制ETEC在IPEC-J2细胞上黏附作用及其机制。结果表明原花青素与益生菌的抗ETEC黏附的效果均与其种类,作用方式、浓度和作用时间相关。LSPC对ETEC的抗黏附效果高于LPOPC,在排斥作用下,LSPC与细胞通过静电与疏水相互作用影响其Zeta电位、显著提高IPEC-J2细胞防御素p BD-2的表达水平,进而使ETEC在细胞上的黏附率和黏附量显著降低。在测定的4种益生菌中,仅LGG在竞争作用和排斥作用下对ETEC具有较好的抗黏附效果,并且LSPC可显著提高LGG产短链脂肪酸的总量和丁酸的含量,进而显著增强其对ETEC的抗黏附效果。LGG与LSPC相互作用显著提高细胞跨膜电阻（TEER）、降低了ETEC诱导的细胞炎症因子水平（TNF-?、IL-8）、提高抗炎因子IL-10的基因水平,提升细胞免疫防御作用和细胞屏障功能。当LGG+LSPC联合处理时,肠上皮细胞中IL-10 m RNA水平显著提高,为对照组的1.89倍。二者在抑制ETEC的黏附中同样显示协同作用,在1×10~9 CFU/m L LGG中添加200?g/m L LSPC时ETEC的黏附率达到最低（4.53%）,提示LGG+LSPC联合作用可效地抑制ETEC在宿主细胞上的黏附和定植,降低宿主的炎症反应。3.莲房原花青素与益生菌联用对ETEC腹泻小鼠的预防效果及保护肠道屏障功能的作用机制通过对ICR小鼠抗生素预处理和灌胃1×10~9cfu/kg·bw ETEC 3天,出现了典型的腹泻症状,成功的构建了ICR小鼠腹泻模型。在正常小鼠中,LSPC、益生菌单独（Bb-12,LGG+Bb-12）或两者联合给药均未对其肠道造成损伤。ETEC攻毒后,给预防组小鼠灌胃LSPC（0.2%w/w和0.5%w/w）,益生菌（10~8cfu/kg?bw P1:LGG或10~8cfu/kg?bw P2:LGG+Bb-12）和LSPC+益生菌（LSPC+P1或LSPC+P2）10 d后,能显著减轻小鼠腹泻症状、改善肠道绒毛形态、降低血清中二胺氧化酶（DAO）水平、提高血液中Na+和Cl-离子浓度。同时,它们还可以显著提高肠道总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量,降低丙二醛（MDA）含量,改善肠道氧化应激水平。另外,下调MAPK信号通路中磷酸化的p38,JNK1/2和ERK1/2蛋白表达水平,对紧密链接蛋白（Occludin,Claudin-1和ZO-1蛋白）水平进行调控;通过激活TLR4-MAPK信号通路,降低ETEC诱导的肠道炎症因子TNF-?,IL-8,1L-1?和IL-6的基因水平。其中,LSPC+Bb-12给药组中小鼠肠道MDA含量最低,T-SOD活性及GSH含量最高,LSPC+（LGG+Bb-12）给药组中小鼠血清中Na+和Cl-离子浓度最大,紧密连接蛋白Occludin,Claudin-1和ZO-1蛋白表达水平达到最大,磷酸化的p38,JNK1/2和ERK1/2水平最低。因而LSPC与益生菌联合给药组的抗腹泻效果优于LSPC或益生菌单独给药组。研究表明单独LSPC、益生菌或两者联用都能通过改善肠道氧化应激水平降低ETEC诱导的肠道损伤,可进一步通过MAPK信号通路调控肠道屏障功能,降低肠道炎症反应达到其抗ETEC有的腹泻作用。4.原花青素与ETEC热不稳定肠毒素相互作用研究首先,通过抑制ETEC肠毒素LTB在细胞上的黏附试验发现,LSPC能够显著降低LTB在细胞上的黏附量,并且存在浓度-效应关系。与对照组相比,LSPC浓度增至200?g/m L时LTB荧光强度下降到最低（6.09±1.24%）。微热泳MST与荧光光谱分析表明LSPC中各组分均与LTB存在较强结合作用和荧光猝灭作用,并且这种结合作用与原花青素结构与构象密切相关。其中,B-型原花青素与LTB作用优于A-型原花青素,儿茶素（Kd=5.851 mmol/L）与原花青素B1（Kd=5.515 mmol/L）显现出最强的结合作用。同步荧光数据显示儿茶素与原花青素B1能够改变LTB酪氨酸残基与色氨酸残基的微环境,引起LTB构象的改变。提示LSPC可与LTB发生结合作用,引起LTB结构变化进而改变其黏附活性。分子模拟和ESI-MS试验证实不同原花青素与LTB结合作用为非共价结合,主要作用力包括氢键和?-?疏水相互作用。这种结合作用力在NMR系列参数中得到验证。通过比较与LTB作用前后原花青素B1的1D NMR谱、纵向弛豫时间T1、横向弛豫时间T2变化发现,原花青素B1中B环和E环与LTB存在较大作用力,~1H谱中丰度显著降低的质子排序为:5′B＞2′B＞5′E＞3C＞2C,T1与T2均发生较大变化的质子为5’E、5’B、2’B、2’E、2C和3C,而与蛋白距离较近的5’E、2C和3C可能是直接与LTB作用的位点相关。结合分子模拟与2D NMR ~1H/13C-HSQC谱判定,原花青素B1上E环5’E质子可能是与LTB直接作用的位点,具体信息尚待进一步研究。