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第一部分肌球蛋白IIA对调节性T细胞发育及功能的影响目的:肌球蛋白II是肌球蛋白超家族的一员,在细胞中执行许多机械动力相关任务。根据重链的不同,可将肌球蛋白II分为肌球蛋白IIA、肌球蛋白IIB和肌球蛋白IIC三个亚型。其中,肌球蛋白IIA（由Myh9基因编码）主要在免疫组织器官中表达。本研究主要基于调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）特异性敲除Myh9基因的小鼠模型,探讨肌球蛋白IIA对Treg细胞发育和功能的影响。方法:首先通过基因型为Myh9flox/+YFP-Foxp3Cre/+的雌性小鼠和Myh9flox/+YFP-Foxp3Cre/Y的雄性小鼠进行杂交,分别得到对照组小鼠（YFP-Foxp3Cre/Y）及Treg细胞特异性敲除Myh9基因的小鼠（YFPFoxp3Cre/YMyh9flox/flox）。在对照组小鼠和Myh9基因敲除模型小鼠中,首先观察小鼠的生存状况及其免疫状态,并分离其免疫器官,观察其大小变化;同时分离其它非免疫组织脏器（肺脏、肾脏、肝脏及皮肤）进行HE染色观察组织淋巴浸润情况;其次,采用流式细胞术检测小鼠的胸腺及外周淋巴组织器官（脾脏、外周淋巴结和肠系膜淋巴结）中CD4+和CD8+T细胞比例及其初始和效应/记忆细胞的比例,同时体外刺激后检测细胞因子的产生;并进一步通过流式细胞术检测CD25+Treg细胞和Foxp3+Treg细胞的比例及抑制功能相关分子（ICOS、CTLA4和PD1）的表达。最后,磁珠富集脾脏CD25+Treg细胞和CD4+初始T细胞,在体外以不同比例将这两群细胞共培养,检测Treg细胞对CD4+初始T细胞增殖的抑制作用。结果:（1）Foxp3Cre/YMyh9flox/flox小鼠表现为严重的致死性自身免疫病,寿命明显缩短,脾脏及外周淋巴结明显增大,HE染色可见肺脏、肾脏、肝脏及皮肤组织中存在广泛淋巴细胞浸润;（2）Foxp3Cre/YMyh9flox/flox小鼠胸腺、脾脏、外周淋巴结和肠系膜淋巴结中的CD4+T细胞中IL2、IL4、IL17和IFNγ生成增多,CD8+T细胞中IFNγ的生成也增多;（3）Foxp3Cre/YMyh9flox/flox小鼠中的CD4+T细胞比例在胸腺中明显增高,在外周免疫器官（外周和肠系膜淋巴结）中降低,且在外周免疫器官（脾脏、外周淋巴结和肠系膜淋巴结）中CD4+和CD8+T细胞中的初始T细胞均显著减少,而效应/记忆T细胞明显增多;（4）Foxp3Cre/YMyh9flox/flox小鼠胸腺中CD25+Treg和Foxp3+Treg的比例均明显增多,而外周则出现Foxp3+Treg细胞比例显著减少;（5）同时发现,在Foxp3Cre/YMyh9flox/flox小鼠中,CD25+Treg细胞中抑制功能相关分子（ICOS、PD-1、CTLA4）表达增高,Foxp3+Treg细胞中抑制功能相关分子（CTLA4）表达也增高;（6）体外抑制功能试验发现Foxp3Cre/YMyh9flox/flox小鼠的脾脏CD25+Treg细胞对CD4+初始T细胞增殖的抑制功能较对照组增强。结论:Treg特异性Myh9基因缺陷小鼠存在致死性的严重自身免疫,具体表现有多器官组织的严重淋巴浸润、T细胞过度激活和细胞因子生成增多;胸腺Treg细胞比例明显增高,而外周Treg细胞明显减少,体外实验提示脾脏CD25+Treg细胞功能增强。目前的研究揭示了肌球蛋白IIA在维持Treg发育和功能中起重要作用。第二部分Mst1/2参与早期BCR信号转导的机制研究目的:Mst1和Mst2（由STK4和STK3基因编码）是Hippo信号通路中两个高度同源的哺乳动物Ste20样激酶。Mst1功能缺失突变可引起免疫缺陷和淋巴细胞减少,同时也可有自身免疫的表现。前期研究发现Mst1/2参与调控了B细胞中枢及外周发育,而早期B细胞受体（B Cell Receptor,BCR）信号通路在B细胞的分化发育中是至关重要的。然而Mst1/2调控早期BCR信号转导的机制尚未阐明。因此,本研究基于基因敲除小鼠模型,探索Mst1/2在早期BCR信号转导中的作用及其分子机制。方法:首先,我们分别构建了以下转基因小鼠模型:Mst1KO小鼠（Mst1-/-）、Mst2KO小鼠（Mst2flox/flox CD19Cre/+）和Mst1/2DKO小鼠（Mst1flox/flox Mst2flox/flox CD19Cre/+）。基于此小鼠模型,首先分离小鼠脾脏,再通过密度梯度离心法获得小鼠脾脏单个核细胞,进一步富集得到脾脏B细胞;接下来,在体外利用可溶性抗原刺激脾脏B细胞,并通过共聚焦显微技术、流式细胞术及蛋白免疫印迹法检测BCR信号通路中关键调控分子和BCR信号转导远端分子的活化水平。同时,构建平面抗原脂质分子层,体外模拟膜相关抗原活化脾脏B细胞,并利用全内反射荧光显微技术在不同时间点动态观察B细胞接触区域的BCR信号转导关键分子活动。结果:（1）使用可溶性抗原刺激脾脏B细胞,与对照组小鼠相比,BCR信号关键调控分子（p CD19、p BTK、p SHIP）和BCR信号转导远端AKT-S6轴的活化水平在Mst1KO小鼠脾脏B细胞中明显下降,在Mst2KO小鼠脾脏B细胞中明显升高,Mst1/2DKO小鼠中无明显变化或稍降低;（2）膜相关抗原激活小鼠脾脏B细胞,全内反射荧光显微镜观察发现,与对照组小鼠相比,Mst1KO小鼠脾脏B细胞中BCR簇形成减少且速度变慢,B细胞扩张受限;Mst2KO小鼠脾脏B细胞中BCR簇形成和B细胞扩张无明显变化;Mst1/2DKO小鼠脾脏B细胞的扩张和BCR簇形成亦减少,但其减少程度低于Mst1KO小鼠;（3）同时,膜相关抗原激活小鼠脾脏B细胞,发现与对照组小鼠相比,BCR信号关键调控分子（p CD19、p BTK、p SHIP）在Mst1KO小鼠脾脏B细胞中明显下降,在Mst2KO小鼠脾脏B细胞中明显升高,Mst1/2DKO小鼠中亦降低,但其降低程度小于Mst1KO小鼠。结论:Mst1/2在早期BCR信号转导中有重要调控作用。其中,Mst1/2通过影响CD19、BTK和SHIP参与B细胞活化过程中早期BCR信号转导。这一研究为解析BCR信号转导和Mst1缺陷导致体液免疫缺陷的分子机制提供了新思路。