论文部分内容阅读
乙烯是一种结构简单的气态植物激素,参与调控植物生长发育以及响应外界环境的各种生物及非生物胁迫,在植物整个生命过程中有不可或缺的作用。大量研究表明乙烯参与保卫细胞的信号转导,对气孔运动具有双重作用,它既可以诱导气孔关闭或介导其它刺激因子如紫外线B（UV-B）、水杨酸和油菜素内酯诱导的气孔关闭,还能够抑制一些刺激因子如ABA和暗诱导的气孔关闭。丝裂原活化蛋白激酶（MPK）途径是真核细胞生物中保守的信号转导途径,植物能够通过活化特定的MPK级联途径从而调控不同的细胞信号转导过程。研究表明MPK级联途径参与了多种刺激因子调控气孔运动的细胞信号转导过程,但目前对于MPK级联途径是否也参与乙烯诱导气孔关闭过程还不清楚;如果参与,组成该MPK级联途径的具体组分有哪些?其与保卫细胞信号分子过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）以及乙烯信号元件之间的关系如何?这些问题目前还不清楚。为了明确以上问题,本研究以模式植物拟南芥为材料,通过遗传学、分子生物学、细胞生物学和生物化学等方法和技术,探究了 MPK级联途径在乙烯诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与信号分子H2O2、NO以及乙烯信号元件之间的相互关系,得到的主要结果和结论如下:1.100μM 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC,乙烯生物合成前体物质）能够诱导拟南芥野生型叶片MPK3和MPK6的活化以及气孔关闭,且ACC诱导MPK3和MPK6活化的时间过程与ACC诱导气孔关闭的时间过程一致;mpk3和mpk6单突变体部分抑制ACC诱导的气孔关闭,4-氨基-1-叔丁基-3-（1’-萘基）吡唑[3,4-d]嘧啶（NA-PP1）处理下的MPK3和MPK6的条件性功能缺失双突变体MPK3SR和MPK6SR能够完全抑制ACC诱导的气孔关闭。这些结果表明MPK3和MPK6参与并正调控乙烯诱导的拟南芥气孔关闭。2.ACC诱导的MPK3和MPK6活化和气孔关闭能够被mkk1和mkk3单突变体部分抑制,但能被mkk1/3双突变体完全抑制;在野生型和mkk1/3双突变体背景下过表达组成活化型MPK6（MPK6CA/WT和MPK6CA/mkk1/3）组成型诱导了拟南芥气孔关闭。结果表明MKK1和MKK3参与乙烯诱导气孔关闭的信号转导过程,且它们的作用依赖于MPK3/6的活化。3.酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和Pull-down的实验结果表明MKK1和MKK3均能与MPK3和MPK6在植物体内和体外发生物理互作,说明MKK1/3和MPK3/6组成了一条MPK级联途径。4.100μM ACC处理能显著诱导拟南芥野生型、mkk1、mkk3、mpk3、mpk6单突变体、mkk1/3双突变体、NA-PP1处理下的条件性功能缺失双突变体MPK3SR和MPK6SR以及MPK6CA/WT和MPK6CA/mkk1/3植株叶片保卫细胞H2O2生成,且ACC诱导MPK3和MPK6的活化被NADPH氧化酶单突变体AtrbohF和双突变体AtrbohD/F显著抑制,而不能被单突变体AtrbohD抑制。结果说明乙烯诱导气孔关闭的信号转导途径中MKK1/3-MPK3/6信号级联途径的作用位于ATRBOHF途径来源的H2O2的下游。5.ACC诱导拟南芥保卫细胞NO生成的效应能被mkk1、mkk3、mpk3和mpk6单突变体部分抑制,被mkk1/3双突变体、NA-PP1处理下的条件性功能缺失双突变体MPK3SR和MPK6SR完全抑制;而无论有没有ACC处理,MPK6CA/WT和MPK6cCA/mkk1/3植株叶片保卫细胞均表现为组成型NO产生;阻断乙烯诱导保卫细胞NO形成的硝酸还原酶突变体nia1和nia1/2并不影响ACC诱导MPK3和MPK6活化。结果说明在乙烯诱导气孔关闭的信号转导途径中MKK1/3-MPK3/6级联途径的作用位于NIA1途径来源的NO的上游。6.与野生型相比,ACC诱导的MPK3和MPK6活化在etr1突变体中被显著抑制,在ein2和ein3突变体中没有受到影响;ctr1突变体叶片表现为组成型MPK3和MPK6的活化;ctr1mkk1/3三突变体的表型与mkk1/3双突变体的一致,其逆转了ctr1单突变体组成型NO生成和气孔关闭的表型;在mkk1/3双突变体背景下过表达EIN3（35S:EIN3/mkk1/3）能组成性诱导保卫细胞NO生成以及气孔关闭。以上结果表明在乙烯诱导气孔关闭的信号转导途径中,MKK1/3-MPK3/6级联途径作用于ETR1和CTR1的下游以及EIN2和EIN3的上游。7.Y2H、BiFC和Pull-down的实验结果表明MPK3和MPK6均能与EIN2的C末端（EIN2C/EIN2CEND）发生物理互作;在拟南芥野生型和MKK1/3-MPK3/6级联途径相关突变体背景下分别过表达EIN2-GFP（GFP连在EIN2的C端）和GFP-EIN2（GFP连在EIN2的N端）,ACC处理能够诱导野生型背景下过表达EIN2-GFP的转基因植株保卫细胞和下胚轴表皮细胞的细胞核内GFP信号的聚集,但该现象均未在野生型背景下过表达GFP-EIN2的转基因植株以及MKK1/3-MPK3/6级联途径相关突变体背景下过表达EIN2-GFP的转基因植株的保卫细胞和下胚轴表皮细胞内观察到。这些结果表明MKK1/3-MPK3/6级联途径通过与EIN2的互作促进了乙烯诱导EIN2C的剪切和入核。8.ACC处理诱导拟南芥野生型叶片中EIN3蛋白的积累,但这种效应在MKK1/3-MPK3/6级联途径突变体被明显抑制,而ctr1突变体表现出组成型的EIN3蛋白积累。结果表明MKK1/3-MPK3/6级联途径介导了乙烯诱导的EIN3蛋白积累。综上所述,本研究不仅为MKK1/3-MPK3/6级联途径在乙烯诱导拟南芥气孔关闭中的重要作用提供了有力证据,并建立了保卫细胞乙烯信号转导通路的潜在模型:乙烯与其受体ETR1的结合导致负调控因子CTR1的失活,使NADPH氧化酶AtRBOHF来源的H2O2产生;保卫细胞中的H2O2激活MKK1/3-MPK3/6信号级联途径,该级联途径通过与EIN2的直接互作促进了 EIN2C的剪切入核,进而促进了 EIN3蛋白的积累;最后EIN3诱导保卫细胞NIA1途径来源的NO产生并导致气孔关闭。