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杂种优势是一种普遍的生物学现象，在农作物新品种选育过程中发挥着不可替代的作用。然而，杂种优势现象十分复杂，迄今为止对杂种优势形成的遗传机理仍不是十分清楚。玉米是世界上第一个成功利用杂种优势的作物，同时也是杂种优势研究的经典模式作物。课题组前期利用玉米单片段代换系测交群体，在单位点水平鉴定出一个控制穗粗杂种优势的主效位点hlEW2b。本研究在此基础上通过构建包含hlEW2b位点的次级分离群体，对hlEW2b进行了精细定位及克隆并利用杂交种及其对应近等基因系幼穗的花序分生组织为材料，通过转录组测序和广泛非靶向代谢物检测等手段，对hlEW2b如何参与调控玉米雌穗发育进行解析。同时，采用不完全双列杂交试验设计，评价了穗粗杂种优势位点hlEW2b的潜在育种应用价值。主要研究结果如下:
1、以含有hlEW2b的单片段代换系为材料，构建了一个包含21000个单株的次级单片段代换系分离群体。采用图位克隆策略，从该群体中筛选获得11种不同交换类型的重组单株(Recombinant lines，RLs)，对重组单株测交后代（郑58×RLs）与对照杂交种（郑58×lx9801）的穗粗表型进行显著性分析，将玉米穗粗杂种优势位点hlEW2b定位在Chr2.03bin的ml-m3标记之间，该区间约274kb，共包含5个候选基因。
2、利用转录组测序和qRT-PCR方法，对定位5个候选基因进行表达分析。结果发现与对照杂交种郑58×lx9801相比，ORF881和ORF882在郑58×lx9801hlEW2b中均显著下调表达，其他3个候选基因在杂交种之间未表现出显著性差异。等位基因特异表达分析结果表明ORF881基因在两个杂交种中均未发生等位基因特异表达，而ORF882在郑58×lx9801hiEW2b中，弱势表达lx9801hlEW2b等位基因，不同于郑58×lX9801中lx9801等位基因和郑58等位基因的等量表达。因此推断ORF882基因在郑58×lx9801hlEW2b杂交种中，lx9801hlEW2b与郑58等位基因的差异表达可能是导致其比郑58×lx9801表现出更强杂种优势的原因。
3、根据蛋白质结构预测分析，发现ORF882编码一个典型的F-box蛋白。构建BD-F-box诱饵载体，对雌穗cDNA酵母文库进行筛选，得到52个候选互作蛋白，其中包括介导蛋白泛素化降解的SCF（SKP1-Cullin1-F-box）复合体亚基SKP1和影响雌穗发育的KN1，表明该穗粗杂种优势基因可能通过介导蛋白质泛素化降解途径调控雌穗的发育进程。
4、雌穗分化过程直接决定成熟雌穗基本形态。利用扫描电镜观察郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801的雌穗花序分生组织(Inflorescence Meristem，IM)，发现郑58×lx9801hlEW2b IM的宽度显著大于对照杂交种郑58×lx9801。通过IM组织的转录组分析，发现杂交种之间差异表达的非加性效应基因被显著富集于“组织发育”和“植物器官发育”等生物学过程。另外，候选基因ORF882表现为非加性表达，且被显著富集在“蛋白酶体组装”生物学过程，表明ORF882可能参与依赖于26S蛋白酶体的蛋白质泛素化降解过程。
5、等位基因特异表达(Allele-specific expression，ASE)是指杂交种中两亲本等位基因的不平衡表达，该现象被认为是杂种优势产生的重要机制。对杂交种郑58×lx9801hiEW2b和郑58×lx9801在全基因组水平上发生ASE的基因进行鉴定，发现有12.89％和14.65％的基因分别在郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801中发生了ASE。GO富集分析结果表明，两个杂交种共有的ASE基因被富集在基础生物过程中，而郑58×lx9801hlEW2b特有的ASE基因则被显著富集在与生物合成及分解代谢相关的生物过程中，表明这些特有的ASE基因，为郑58×lx9801hlEW2b旺盛的物质代谢提供支撑，是其表现较强杂种优势的基础。
6、代谢物作为一种小分子化合物，直接参与生物体的新陈代谢过程，其积累模式可以直接影响植物生长发育。本研究利用广泛非靶向代谢物检测技术在郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801及其对应近等基因系中共检测到256种次级代谢物。其中，31种代谢物在杂交种郑58×lx9801hiEW2b和郑58×lx9801之间差异积累;24种代谢物在lx9801hlEW2b和lx9801之间差异积累。鸟嘌呤-5-磷酸(GMP)和鸟嘌呤(Guanine)属于重要的核苷酸类代谢物，参与核苷酸代谢途径，直接影响植物体内的细胞组分和碳水化合物合成;烟酰胺和葫芦巴碱主要参与调节细胞膨大;黄酮类代谢物可以调节生长素转运及细胞凋亡;激素代谢途径中的细胞分裂素活性物质反式玉米素核苷(trans-Zeatin Riboside，tZR)，可以显著调控细胞周期和细胞增殖。总之，这些差异积累代谢物所涉及的代谢途径可能对玉米雌穗发育产生重要的影响。
7、利用12个属于不同杂种优势类群的玉米骨干自交系，分别与lx9801hlEW2b和lx9801杂交。表型鉴定结果表明，不同遗传背景杂交组合的穗部杂种优势表现明显不同。其中，lx9801hlEW2b与丹340、齐319、沈5003和6WC杂交组合的穗粗和单穗重均显著高于相应的lx9801杂交组合，说明杂种优势位点hlEW2b对杂种优势的产生具有通用性。然而在同一种杂种优势利用模式下，不同杂交组合之间的杂种优势表现同时还存在明显差异，表明杂种优势是特定组合之间特异等位基因互作的结果。因此，认为玉米穗粗杂种优势位点hlEW2b在生产中具有一定的利用价值。
综上所述，本研究通过对玉米穗粗杂种优势位点hlEW2b的精细定位及候选基因差异表达分析，初步确定了ORF882为hlEW2b的候选基因，其在郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801之间的差异表达及在郑58×lx9801hlEW2b中的等位基因特异表达，是造成两个杂交种穗部杂种优势差异表现的主要原因。此外，综合候选基因ORF882下游互作蛋白筛选结果和玉米雌穗扫描电镜观察及转录组、代谢组分析结果，推断玉米雌穗发育过程中蛋白质泛素化降解相关基因的差异表达、激素相关基因的非加性表达、物质代谢相关基因的等位基因特异表达及代谢物差异积累，可能是hlEW2b参与调控玉米穗粗杂种优势形成的主要方式。
1、以含有hlEW2b的单片段代换系为材料，构建了一个包含21000个单株的次级单片段代换系分离群体。采用图位克隆策略，从该群体中筛选获得11种不同交换类型的重组单株(Recombinant lines，RLs)，对重组单株测交后代（郑58×RLs）与对照杂交种（郑58×lx9801）的穗粗表型进行显著性分析，将玉米穗粗杂种优势位点hlEW2b定位在Chr2.03bin的ml-m3标记之间，该区间约274kb，共包含5个候选基因。
2、利用转录组测序和qRT-PCR方法，对定位5个候选基因进行表达分析。结果发现与对照杂交种郑58×lx9801相比，ORF881和ORF882在郑58×lx9801hlEW2b中均显著下调表达，其他3个候选基因在杂交种之间未表现出显著性差异。等位基因特异表达分析结果表明ORF881基因在两个杂交种中均未发生等位基因特异表达，而ORF882在郑58×lx9801hiEW2b中，弱势表达lx9801hlEW2b等位基因，不同于郑58×lX9801中lx9801等位基因和郑58等位基因的等量表达。因此推断ORF882基因在郑58×lx9801hlEW2b杂交种中，lx9801hlEW2b与郑58等位基因的差异表达可能是导致其比郑58×lx9801表现出更强杂种优势的原因。
3、根据蛋白质结构预测分析，发现ORF882编码一个典型的F-box蛋白。构建BD-F-box诱饵载体，对雌穗cDNA酵母文库进行筛选，得到52个候选互作蛋白，其中包括介导蛋白泛素化降解的SCF（SKP1-Cullin1-F-box）复合体亚基SKP1和影响雌穗发育的KN1，表明该穗粗杂种优势基因可能通过介导蛋白质泛素化降解途径调控雌穗的发育进程。
4、雌穗分化过程直接决定成熟雌穗基本形态。利用扫描电镜观察郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801的雌穗花序分生组织(Inflorescence Meristem，IM)，发现郑58×lx9801hlEW2b IM的宽度显著大于对照杂交种郑58×lx9801。通过IM组织的转录组分析，发现杂交种之间差异表达的非加性效应基因被显著富集于“组织发育”和“植物器官发育”等生物学过程。另外，候选基因ORF882表现为非加性表达，且被显著富集在“蛋白酶体组装”生物学过程，表明ORF882可能参与依赖于26S蛋白酶体的蛋白质泛素化降解过程。
5、等位基因特异表达(Allele-specific expression，ASE)是指杂交种中两亲本等位基因的不平衡表达，该现象被认为是杂种优势产生的重要机制。对杂交种郑58×lx9801hiEW2b和郑58×lx9801在全基因组水平上发生ASE的基因进行鉴定，发现有12.89％和14.65％的基因分别在郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801中发生了ASE。GO富集分析结果表明，两个杂交种共有的ASE基因被富集在基础生物过程中，而郑58×lx9801hlEW2b特有的ASE基因则被显著富集在与生物合成及分解代谢相关的生物过程中，表明这些特有的ASE基因，为郑58×lx9801hlEW2b旺盛的物质代谢提供支撑，是其表现较强杂种优势的基础。
6、代谢物作为一种小分子化合物，直接参与生物体的新陈代谢过程，其积累模式可以直接影响植物生长发育。本研究利用广泛非靶向代谢物检测技术在郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801及其对应近等基因系中共检测到256种次级代谢物。其中，31种代谢物在杂交种郑58×lx9801hiEW2b和郑58×lx9801之间差异积累;24种代谢物在lx9801hlEW2b和lx9801之间差异积累。鸟嘌呤-5-磷酸(GMP)和鸟嘌呤(Guanine)属于重要的核苷酸类代谢物，参与核苷酸代谢途径，直接影响植物体内的细胞组分和碳水化合物合成;烟酰胺和葫芦巴碱主要参与调节细胞膨大;黄酮类代谢物可以调节生长素转运及细胞凋亡;激素代谢途径中的细胞分裂素活性物质反式玉米素核苷(trans-Zeatin Riboside，tZR)，可以显著调控细胞周期和细胞增殖。总之，这些差异积累代谢物所涉及的代谢途径可能对玉米雌穗发育产生重要的影响。
7、利用12个属于不同杂种优势类群的玉米骨干自交系，分别与lx9801hlEW2b和lx9801杂交。表型鉴定结果表明，不同遗传背景杂交组合的穗部杂种优势表现明显不同。其中，lx9801hlEW2b与丹340、齐319、沈5003和6WC杂交组合的穗粗和单穗重均显著高于相应的lx9801杂交组合，说明杂种优势位点hlEW2b对杂种优势的产生具有通用性。然而在同一种杂种优势利用模式下，不同杂交组合之间的杂种优势表现同时还存在明显差异，表明杂种优势是特定组合之间特异等位基因互作的结果。因此，认为玉米穗粗杂种优势位点hlEW2b在生产中具有一定的利用价值。
综上所述，本研究通过对玉米穗粗杂种优势位点hlEW2b的精细定位及候选基因差异表达分析，初步确定了ORF882为hlEW2b的候选基因，其在郑58×lx9801hlEW2b和郑58×lx9801之间的差异表达及在郑58×lx9801hlEW2b中的等位基因特异表达，是造成两个杂交种穗部杂种优势差异表现的主要原因。此外，综合候选基因ORF882下游互作蛋白筛选结果和玉米雌穗扫描电镜观察及转录组、代谢组分析结果，推断玉米雌穗发育过程中蛋白质泛素化降解相关基因的差异表达、激素相关基因的非加性表达、物质代谢相关基因的等位基因特异表达及代谢物差异积累，可能是hlEW2b参与调控玉米穗粗杂种优势形成的主要方式。