【摘 要】
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蛋白质药物是一类独特且用途广泛的生物治疗药物,不仅具有高生物活性,而且具有极强的特异性。然而,具有细胞内靶标的抗肿瘤蛋白质的临床转化受到其在体内快速降解、细胞膜穿透性差等限制的严重阻碍。特别是蛋白质固有的表面不同电荷性及大分子亲水性,给寻求蛋白质跨细胞递送带来了极大的挑战。因此本论文通过对蛋白质表面氨基的羧基化来单一化蛋白质表面的复杂电荷,设计胞质内还原响应的蛋白质递送体系,为蛋白质药物的精准递送
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蛋白质药物是一类独特且用途广泛的生物治疗药物,不仅具有高生物活性,而且具有极强的特异性。然而,具有细胞内靶标的抗肿瘤蛋白质的临床转化受到其在体内快速降解、细胞膜穿透性差等限制的严重阻碍。特别是蛋白质固有的表面不同电荷性及大分子亲水性,给寻求蛋白质跨细胞递送带来了极大的挑战。因此本论文通过对蛋白质表面氨基的羧基化来单一化蛋白质表面的复杂电荷,设计胞质内还原响应的蛋白质递送体系,为蛋白质药物的精准递送及可控释放提供一种新策略。具体研究内容及结果如下:1.蛋白质表面的可逆羧基化修饰及表征通过设计并制备氨基反应性还原敏感接头NC-ss-COOH,我们将蛋白质表面的阳离子氨基有效转换为阴离子羧基。经过质谱及电泳的表征,羧基化后的牛血清白蛋白（BSA）、核糖核酸酶（RNase）和过氧化氢酶（CAT）的分子量明显增大且表面电势显著降低,证实了各组阴离子前蛋白的成功制备。2.载体/蛋白质聚离子胶束的制备及表征通过动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）的表征,验证了阴离子前蛋白可以很容易地与阳离子聚合物快速静电组装成聚离子胶束,以促进细胞内吞作用。各组前蛋白胶束粒径均在80-100 nm,表面电势呈3-5 m V的电中性;MTT实验的高细胞存活率结果证实了我们设计的蛋白质递送系统具有良好的生物相容性。3.载体/蛋白质聚离子胶束的还原响应性及胞内递送由于中间二硫键的硫解作用,羧基化前蛋白能够对细胞质内富含的谷胱甘肽（GSH）快速响应,同时产生的巯基触发级联亲核反应,使修饰后的羧基逆转为原始氨基。通过质谱检测到前蛋白在10 m M GSH缓冲液中分子量迅速降低,证实了其的快速还原响应;DLS和TEM测试证明聚离子胶束在10 m M GSH溶液中迅速解离;通过激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）和流式细胞仪（FCM）观察到,无修饰组中细胞几乎没有蛋白摄取,相比之下前蛋白胶束递送组细胞内的荧光强度增加约500倍,递送效率极大提高。4.蛋白质递送后在细胞内活性的验证随后使用RNase和CAT作为模型酶,通过CLSM观察到RNase递送组对MCF-7肿瘤细胞展现了显著的杀伤效果;递送进CAT的细胞成功清除了外源低浓度过氧化氢。综上所述,我们设计了一种还原响应型的电荷反转策略,用于构建胞质内可激活的前蛋白聚离子胶束,为实现蛋白质治疗剂的跨细胞递送提供了一种简便通用的方法。
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