研究背景 脂质代谢紊乱,可导致脂质代谢失衡,并引起机体的一系列代谢失调,包括血脂水平的异常。其中,胆固醇异常升高所致的高胆固醇血症已被证明是引发心血管疾病的独立危险因素。高胆固醇血症目前常用药物调脂进行防治,目前临床上已有多种通过不同作用机制调节胆固醇水平的降脂药物,如他汀类,可直接抑制肝组织胆固醇的从头合成,因而是临床应用最为广泛、种类最多的降脂药;PCSK9抑制剂可增加肝脏对血液胆固醇的摄取。随着降脂药在临床应用的迅速增加,降脂药及适宜人群的选择,降脂不达标、耐药、药物毒性等问题日益凸显,例如他汀类药物出现降脂效果个体差异大,易引发横纹肌损伤、肝功能异常等。因此,细致研究代谢调节机制、发现用药指导标志物来指导适宜亚群合理用药是临床急需解决的问题。细胞内质网是蛋白质折叠成熟的质控中心,同时也是细胞的钙库以及脂质的合成中心;还通过与高尔基体、线粒体等交流发挥协同调节作用。因此ER是蛋白质、糖脂代谢的协同调节核心。由于参与脂质代谢的许多酶均含有半胱氨酸,课题组长期关注内质网二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）对脂质代谢的影响,并发现PDI家族成员AGR2（Anterior gradient 2）具有促进脂质合成和脂肪蓄积的作用,并且AGR2可增加血清胆固醇水平、拮抗他汀类药物的降脂效果,但AGR2调节胆固醇代谢的机制以及AGR2的临床意义等尚不清楚。本论文利用AGR2全身敲除鼠（Agr2-/-）和AGR2转基因鼠（Agr2/Tg）,并构建AGR2肝脏特异性敲除鼠（Agr2/LKO）,通过建立高脂动物模型以及利用细胞分子生物学、蛋白组学等技术,分析AGR2调节胆固醇代谢的机制,并利用临床样本分析AGR2潜在的临床应用价值。研究内容 第一部分AGR2促进肝脏胆固酵合成的作用机制 课题组前期研究表明,AGR2提高总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的血清表达水平,但其调控机制尚不清楚。本课题首先利用Alb-Cre重组酶系统构建了 AGR2肝脏特异性敲除小鼠（Agr2 fl/fl;Alb-Cre,AGR2 liver specific knockout mice,Agr2/LKO mice）,并利用AGR2全身敲除鼠（Agr2-/-mice）和AGR2转基因鼠（Agr2/Tg mice）,通过给小鼠构建高脂模型,对AGR2参与胆固醇代谢的调控作用及机制进行探究。一、AGR2肝脏特异性敲除小鼠基本功能分析1.AGR2肝脏敲除小鼠（Agr2/LKO）高脂饮食条件下体重增长缓慢:在正常饮食条件下,Agr2/LKO小鼠体重增长与对照组小鼠并无明显差异;在高脂饮食情况下,Agr2/LKO小鼠体重增长慢、体型偏瘦。表明肝脏AGR2的缺失可以拮抗高脂饮食所诱导的脂质蓄积。2.Agr2/LKO小鼠血脂水平降低:在正常饮食条件下,Agr2/LKO小鼠血清TC,LDL-C含量低;高脂饮食条件下,小鼠肝脏特异性敲除AGR2后降低了TG,TC和LDL-C在血清中的含量,表明肝组织AGR2的缺失可降低胆固醇的分泌。3.AGR2在肝脏的缺失损伤肝功能:本课题测定了 Agr2/LKO小鼠血清肝功指标,结果表明,小鼠在正常和高脂饮食条件下,谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平均高于对照组小鼠（Agr2fl/fl）,并且在高脂饮食条件下,Agr2fl/fl鼠肝脏有明显的脂质蓄积,而Agr2/LKO小鼠脂滴空泡不明显。以上结果表明,AGR2在肝脏的敲除使脂质蓄积降低,胆固醇在血清中的含量下降,并伴有肝功能损伤,且在高脂饮食情况下损伤加重。二、AGR2促进肝脏胆固醇的从头合成 1.AGR2促进胆固醇的合成及分泌:除了验证Agr2-/-鼠和Agr2/LKO鼠在正常和高脂饮食情况下,血清胆固醇含量显著降低之外,本课题特别分析Agr2/LKO鼠肝组织中胆固醇含量,结果显示,肝组织敲除AGR2显著降低胆固醇含量;与之相反,AGR2转基因鼠（Agr2/Tg）在高脂饮食时,血清和肝脏中胆固醇水平升高。2.高脂饮食诱导AGR2表达和分泌:通过分析Agr2/Tg鼠经高脂饮食后的AGR2水平,发现其肝脏的AGR2表达水平显著升高,且小鼠血清分泌的AGR2也显著增加,表明AGR2是诱导性蛋白,高脂诱导可增加其表达和分泌。3.AGR2通过上调HMGCR和SQLE的表达促进胆固醇合成 上述Agr2/LKO、Agr2/Tg鼠肝脏胆固醇的变化结果表明,AGR2可能影响肝脏胆固醇的合成,由于胆固醇合成主要在肝脏完成,本实验进一步分析了AGR2对肝组织胆固醇从头合成途径的影响:1)利用小鼠肝组织对胆固醇从头合成MVA（mevalonate）途径相关酶进行筛选,发现在Agr2-/-鼠和Agr2/LKO鼠中HMGCR（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase）和 SQLE（squalene epoxidase）表达显著下调,而在Agr2/Tg鼠中HMGCR和SQLE表达上调,但对MVA途径的其它基因无显著影响,表明AGR2具有促进胆固醇从头合成的作用,可能通过MVA合成途径的关键酶HMGCR和SQLE发挥作用。2)AGR2促进HMGCR和SQLE的表达:在Huh7细胞（AGR2高表达）中敲低AGR2,HMGCR和SQLE表达减少;在HepG2细胞（AGR2低表达）中过表达AGR2后,促进HMGCR和SQLE的表达;而过表达AGR2关键功能结构域（第81-84位的CPHS氨基酸残基）突变质粒AGR2-C81A后,对HMGCR和SQLE的表达无显著影响,表明AGR2调节胆固醇合成关键酶,其调控作用可能依赖于二硫键异构酶结构域。以上结果显示,AGR2通过增加HMGCR的表达,进而活化MVA信号、促进胆固醇的从头合成。三、AGR2通过激活AKT/mTOR/SREBP2通路促进胆固醇从头合成由于AGR2能够促进HMGCR和SQLE的表达,而SQLE位于MVA途径的下游,因此本研究推测AGR2可能通过上游关键酶HMGCR发挥促进胆固醇合成的作用。但免疫共沉淀实验、以及通过STING蛋白互作数据库分析,均未发现AGR2与HMGCR存在相互作用,而且HMGCR不含二硫键,因此,AGR2可能通过影响HMGCR的调控因子发挥调控功能。由于INSIG2（insulin-induced gene 2）、SREBP2（sterol regulatory element-binding protein-2）等都是已被证实的HMGCR的调控因子,本研究随后分析AGR2对INSIG2、SREBP2的影响:1.AGR2促进SREBP2成熟活化1)AGR2对INSIG2的调节作用不显著:本实验测定了Agr2-/-鼠和Agr2/Tg鼠肝脏的INSIG2表达水平,发现其变化趋势并不明显,因此AGR2可能不是通过影响INSIG2表达而促进胆固醇合成的。2)AGR2促进SREBP2的成熟:通过分析Agr2-/-鼠、Agr2/LKO鼠肝组织SREBP2的表达,发现SREBP2的前体蛋白（precursor-SREBP2）水平变化不明显,而SREBP2剪切后转为成熟的m-SREBP2（mature-SREBP2）表达减少,而Agr2/Tg鼠肝组织m-SREBP2表达增加,表明AGR2对SREBP2表达无显著影响,但具有促进SREBP2的成熟活化的功能。3)AGR2促进SREBP2的成熟可能不依赖于其功能结构域:在Huh7细胞中敲低AGR2后,m-SREBP2降低;而在HepG2细胞中过表达AGR2,m-SREBP2水平增加,但过表达AGR2结构域突变质粒AGR2-C81A后,SREBP2的成熟形式并无显著降低,表明AGR2可能不是通过其二硫键异构酶作用促进SREBP2成熟活化。2.AGR2通过促进AKT和mTOR的磷酸化活化调控SREBP2的成熟 由于过表达AGR2结构域突变质粒AGR2-C81后对m-SREBP2影响不大,并且SREBP2中不含有二硫键,因此AGR2可能不是通过发挥二硫键异构酶功能调控SREBP2表达的。由于AKT/mTOR通路是激活SREBP2的经典途径,因此本课题分析AGR2是否影响AKT/mTOR的活化。1)AGR2促进AKT和mTOR的磷酸化:通过测定AGR2肝脏和全身敲除鼠肝脏中的AKT和mTOR表达水平,结果显示,AKT和mTOR的磷酸化水平均下降,而AGR2转基因鼠肝脏AKT和mTOR的磷酸化水平增加,表明AGR2 激活 AKT/mTOR 信号。2)AGR2的PDI结构域参与AKT信号的活化:在Huh7细胞中敲低AGR2,AKT和mTOR的磷酸化水平降低;而在HepG2细胞中过表达AGR2,AKT和mTOR的磷酸化水平均有所增加,而转染突变质粒AGR2-C81A后二者的磷酸化水平并有未显著变化,表明AGR2对AKT和mTOR的激活作用一定程度上依赖于AGR2的二硫键异构酶结构域。3)AGR2促进胆固醇合成的作用部分依赖于AKT信号:为了确定AKT信号在AGR2促进胆固醇合成中的作用,本课题用P407（poloxamer 407）诱导Agr2/Tg鼠建立急性高脂血症模型,并通过注射PI3K抑制剂降低AKT活性后,分析肝胆固醇含量变化。结果显示,抑制剂可显著降低野生对照鼠（WT鼠）以及Agr2/Tg鼠AKT的磷酸化水平,并发现与WT鼠相比,HMGCR表达在Agr2/Tg鼠中降低更为明显;在WT鼠中,抑制剂对高脂诱导的胆固醇合成（肝）和分泌（血清）无显著影响,而在Agr2/Tg鼠中,抑制AKT活性可降低AGR2诱导的胆固醇合成和分泌,表明,AKT信号部分参与AGR2介导的胆固醇合成和分泌。另外在HepG2细胞中过表达AGR2并经抑制剂处理后,AGR2可部分降低抑制剂对AKT的作用,同时HMGCR表达也比对照细胞高。表明AGR2可以通过激活AKT信号通路、上调HMGCR表达进而促进胆固醇合成。第二部分AGR2影响胆汁酸的代谢及肠肝循环 由于AGR2可以促进胆固醇的从头合成,本研究进一步分析Agr2-/-鼠的肝组织定量蛋白质组学数据中与胆固醇代谢相关的信号,GO和KEGG信号分析结果显示,敲除AGR2后显著变化的信号中,与胆汁酸代谢相关的蛋白也发生变化,提示AGR2可能还调节胆固醇向胆汁酸的转化代谢,因此本研究对AGR2是否调节胆汁酸代谢进行分析,结果如下:一、AGR2影响小鼠血清和排泄物中胆汁酸水平 本课题首先对Agr2-/-鼠和Agr2/Tg鼠血清、肝脏和粪便中的总胆汁酸（Total bile acid,TBA）水平进行测定,发现Agr2-/-鼠肝脏TBA含量下降,粪便TBA含量有所升高;而Agr2/Tg鼠肝脏TBA含量有所增加,粪便TBA含量减少。表明AGR2可能也促进胆固醇的转化,即促进胆汁酸的合成以及肠肝循环。二、AGR2影响胆汁酸转运蛋白SLCO1A1和SULT2A1的表达 本课题进一步分析AGR2对胆汁酸代谢相关基因的影响,通过对Agr2-/-及Agr2/Tg鼠的肝脏进行胆汁酸代谢途径相关基因的筛选,并在蛋白水平进行验证,发现在 Agr2-/-鼠中 SLCO1A1（solute carrier organic anion transporter family,member lal）表达下调,SULT2A1（bile salt sulfotransferase l）表达上调;而在Agr2/Tg鼠中出现相反结果,即SLCO1A1表达上调,SULT2A1表达下调。由于SLCO1A1是参与胆汁酸重吸收的重要转运蛋白,而SULT2A1可使胆汁酸转化为硫酸盐结合物而促进其排泄。以上结果显示,AGR2可以通过调控胆汁酸转运蛋白的表达影响小鼠肝脏和粪便的总胆汁酸含量,以及胆汁酸的转化代谢,但调控机制需要进一步研究。三、AGR2具有缓解胆汁淤积的作用 由于AGR2影响胆汁酸的代谢,那么AGR2是否与胆汁酸代谢异常相关的疾病有关?本课题通过构建胆汁淤积模型分析AGR2的变化,以及AGR2的表达水平对胆汁淤积的影响。结果如下:1.胆汁淤积过程中血清AGR2的分泌增加:通过常规诱导方式（喂养小鼠含0.1%DDC的饲料）构建胆汁淤积模型,2周后小鼠血清TBA,总胆红素和总胆固醇显著升高,表明淤积模型构建成功。本实验测定了小鼠胆汁淤积过程中血清AGR2水平,发现在模型诱导2周内,AGR2的在分泌水平的表达逐渐增加,表明胆汁淤积过程中可诱导AGR2的表达及分泌,可能与DDC诱导内质网应激进而上调AGR2等应答基因的表达有关。2.AGR2缺失导致胆汁淤积模型中肝损伤加重:通过测定Agr2-/-鼠及Agr2/Tg鼠血清、肝脏和粪便中的TBA含量,发现Agr2-/-鼠血清的TBA水平增加,并且胆囊结石更加严重;而Agr2/Tg鼠血清TBA与野生鼠相比差异不大,肝脏中的TBA略有升高。表明AGR2缺失会加重胆汁淤积以及其诱发的肝损伤。3.胆汁淤积后,小鼠肝脏组织中SLCO1A1的表达与AGR2水平呈正相关:通过测定胆汁淤积后Agr2-/-鼠及Agr2/Tg鼠肝脏中的SLCO1A1和SULT2A1蛋白表达水平,发现在胆汁淤积时,Agr2-/-鼠肝脏中的SLCO1A1表达下降,而Agr2/Tg鼠肝脏中的SLCO1A1表达上调。由于SLCO1Al参与胆汁酸的肠肝循环,上述结果表明AGR2可能通过上调SLCO1Al的表达,提高了胆汁酸的重吸收能力并改善肝功能,使血清中的TBA含量有所下降,缓解了胆汁淤积损伤程度,其调控机制课题组正在探索中。第三部分分泌AGR2作为标志物的应用分析 根据AGR2在肝脏胆固醇代谢中的作用,提示AGR2可能具有肝脏保护作用,同时AGR2受高脂诱导分泌增加,本实验利用Agr2-/-鼠和Agr2/Tg鼠,分析AGR2对高脂、他汀药物处理后肝功能的影响,以及分泌AGR2与肝功指标、他汀药物药效的相关性。一、AGR2可减轻高脂饮食及药物所致肝损伤 本实验在构建Agr2/LKO鼠时已发现,肝脏中AGR2缺失可导致AST、ALT的分泌增加（第一部分）,AGR2是否对高胆固醇血症、他汀药物所致肝功异常具有保护作用也成为本课题关注的问题。1.AGR2可缓解药物诱发的肝毒性:通过测定高脂饮食联用洛伐他汀后Agr2/Tg鼠血清AST,ALT水平,并对肝组织进行了 H＆E染色分析,结果表明,高脂饮食联用洛伐他汀治疗后,Agr2/Tg鼠血清ALT含量低于野生对照鼠（WT）,并且WT鼠肝细胞出现点状坏死,而Agr2/Tg鼠肝脏无明显变化,提示AGR2对高脂饮食联合药物引发的肝功能损伤具有保护作用。2.AGR2可降低药物诱导的肝细胞的凋亡:本课题分析了 Agr2/Tg鼠在正常饮食和高脂饮食及联用洛伐他汀条件下,肝组织凋亡指标PARP（poly（ADP-ribose）polymerase）的剪切和Caspase-3的表达水平,结果表明Agr2/Tg鼠肝细胞的凋亡低于野生对照鼠,TUNEL染色,可见Agr2/Tg小鼠肝脏阳性染色细胞百分比低于野生对照鼠,提示AGR2可通过降低肝细胞的凋亡发挥对肝功能的保护作用。二、AGR2可减轻胆汁淤积所致肝损伤 1.AGR2降低肝功能损伤:通过对胆汁淤积造模前后的Agr2-/-鼠和Agr2/Tg鼠血清肝功进行测定,结果和前期一致,即Agr2-/-小鼠AST,ALT水平有所升高,在胆汁淤积后AST,ALT升高更加明显,肝功受损严重;而Agr2/Tg鼠胆汁淤积后血清AST,ALT水平低,肝脏合成功能在胆汁淤积前后均好于野生对照鼠,表明AGR2可预防和保护胆汁淤积引起的肝功能损伤。2.AGR2减少肝胆管胆色素结晶的形成:H＆E染色结果显示,正常饮食情况下,Agr2--鼠和Agr2/Tg鼠肝组织形态均无明显变化;胆汁淤积后,Agr2-/-鼠胆管中的胆色素结晶多于野生对照鼠,进一步证实AGR2的肝保护作用。三、血清AGR2水平与肝功酶存在负相关 通过分析患有肝胆系统疾病患者的临床血液样本,发现血清中分泌的AGR2与AST,ALT,TBA的水平呈负相关,而与表征肝脏合成功能的胆碱酯酶水平呈正相关,即AGR2高表达的患者其肝损伤水平低,AGR2对肝细胞及肝功能具有一定程度的保护作用。四、血清分泌的AGR2水平与他汀降脂药的药效呈负相关 课题组前期已利用Agr2-/-鼠和Agr2/Tg鼠确定了 AGR2高表达介导他汀耐药、降低其对高胆固醇血症的治疗效果,而联用大蒜素可增敏他汀的药效。根据本论文AGR2对胆固醇合成及转化的作用,本课题进一步分析AGR2与他汀药效的相关性。通过对高脂血症患者应用他汀药物治疗前后的临床血样进行分析,发现血清分泌AGR2水平高的患者,在应用他汀药物后,血脂TC和LDL-C下降幅度小,但与甘油三酯、高密度脂蛋白-胆固醇无显著的相关性,证实AGR2拮抗他汀药物的降脂药效。综上,AGR2在胆固醇合成、肝功能及他汀药效中发挥双刃剑作用,分泌AGR2可作为他汀药物的用药标志物,较高的基础表达水平能够降低他汀药物的药效及肝毒性,可通过联合用药方案提高他汀药效并发挥AGR2的肝保护作用。结论 1.AGR2通过活化AKT/mTOR/SREBP2通路,促进SREBP2的成熟入核,从而使HMGCR表达上调,促进肝组织中胆固醇的从头合成。2.AGR2通过上调肝组织中SLCO1A1的表达,促进胆汁酸重吸收和肠肝循环,减少胆汁淤积对肝细胞的损伤,提高了胆汁酸循环利用率;3.AGR2可减轻高脂饮食、药物及胆汁淤积所诱发的肝损伤,血清分泌的AGR2水平与肝功指标、他汀类药物的降脂效果存在负相关,分泌AGR2可作为他汀药物的用药标志物。创新点 1.发现AGR2促进肝胆固醇合成的作用及机制,AGR2可作为反映人体胆固醇合成能力的潜力标志物;2.AGR2在胆固醇合成、肝功能及他汀的降脂药效方面发挥双刃剑的作用:高水平的AGR2具有肝保护作用、抵抗肝损伤的能力更强,然而促进胆固醇合成,易对他汀类药物的产生耐药。3.分泌的AGR2与肝损伤指标、他汀药效呈负相关,可作为临床用药的潜力标志物。不足之处1.AGR2对胆固醇转化为胆汁酸种类的影响、转化关键酶的调控机制,以及对SLCO1Al参与胆汁酸的肠肝循环的调控机制未做详细探讨;2.AGR2对AKT的调控机制尚未确定,从研究结果发现,AKT信号只是AGR2促进胆固醇合成的机制之一,其他信号通路/关键蛋白介导AGR2调控胆固醇合成的作用及机制需进一步深入探讨。