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猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体感染引起的一种严重危害养猪业的呼吸系统传染病。本实验室已经证明猪肺炎支原体能进入猪肺泡巨噬细胞造成LC3-Ⅱ的累积,诱导细胞自噬发生。本文拟研究猪肺炎支原体诱导的自噬流完整性及自噬对猪肺炎支原体在胞内生长的影响,同时希望初步了解影响猪肺炎支原体诱导自噬流完整性的宿主细胞分子。1.猪肺炎支原体AH株感染3D4/21细胞最佳感染复数及自噬调节剂处理3D4/21细胞最佳浓度的研究目的:确定AH株感染3D4/21细胞最佳感染复数及自噬调节剂处理3D4/21细胞最佳浓度。方法:首先测定了猪肺炎支原体AH株的生长曲线。接着用AH株感染3D4/21细胞后CCK-8测定了AH株感染3D4/21细胞的最佳感染复数。用不同浓度的雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1和羟氯喹处理3D4/21细胞,确定这些自噬调节剂的最佳工作浓度及对细胞的毒性。结果:AH株的生长曲线为Y=161.01X-18.633(X代表OD600nm,Y代表Ig CCU),感染3D4/21细胞的最佳感染复数为200。雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1和羟氯喹处理3D4/21细胞的最佳工作浓度分别为1000 nmol/L、5 mmol/L、200 nmol/L和25μmol/L,最佳工作浓度的自噬调节剂对3D4/21细胞的细胞活力均无影响。结论:确定了AH株的生长曲线,AH株感染3D4/21细胞的最佳感染复数,这些自噬调节剂的最佳工作浓度及对细胞的毒性,为后续的试验奠定了基础。2.猪肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞对自噬流完整性的影响目的:确定猪肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞后形成的自噬流的完整性。方法:在有猪支原体肺炎典型病变猪肺脏收集猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophage,PAM）30份,无病变猪肺脏收集PAM 10份,Western blot检测PAM中Mhp366、LC3-Ⅱ和p62表达量变化;间接免疫荧光检测PAM内LC3与Mhp366/LAMP2共定位情况。用AH株感染3D4/21细胞,Western blot检测p62蛋白表达情况,荧光显微镜观察3D4/21细胞中GFP-LC3与RFP-LC3、GFP-LC3与Lyso-Tracker Red的共定位情况,间接免疫荧光检测LC3与LAMP2的共定位情况。结果:猪肺炎支原体阳性PAM中LC3-Ⅱ和p62的表达明显高于猪肺炎支原体阴性PAM中这两个蛋白的表达;AH株感染3D4/21细胞后p62蛋白的表达明显升高。在猪肺炎支原体阳性PAM中Mhp366蛋白与LC3形成共定位;在猪肺炎支原体阴性PAM中LC3与LAMP2共定位数量明显多于猪肺炎支原体阳性PAM中共定位数量;AH株感染组中LC3未与LAMP2形成共定位,黄色荧光斑点数量（m RFP+GFP+）显著高于红色荧光斑点数量（m RFP+GFP-）。EBSS组GFP-LC3与Lyso-Tracker Red共定位数量显著多于AH株感染组的共定位数量。结论:猪肺炎支原体感染PAM和3D4/21细胞诱导发生不完全自噬。3.自噬对猪肺炎支原体在胞内增殖影响的研究目的:确定自噬是否影响猪肺炎支原体在胞内的增殖。方法:3-甲基腺嘌呤处理3D4/21细胞后,分别用MOI=2和MOI=200的AH株感染3D4/21细胞,Western blot检测LC3-Ⅱ、p62和P97蛋白表达情况,测定细胞内AH株的颜色变化单位（Colour changing unit,CCU）。MOI=2和MOI=200的AH株感染3D4/21细胞后,雷帕霉素、巴弗洛霉素A1或羟氯喹处理细胞,Western blot检测LC3-Ⅱ、p62和P97蛋白表达情况,测定细胞内AH株的CCU。结果:AH株（MOI=2、MOI=200）感染3D4/21细胞后,3-甲基腺嘌呤处理组LC3-Ⅱ、p62和P97蛋白表达量和细胞内AH株的CCU均显著低于3-甲基腺嘌呤未处理组的蛋白表达量和细胞内AH株的CCU。MOI=2的AH株感染3D4/21细胞后,雷帕霉素、巴弗洛霉素A1或羟氯喹处理细胞,细胞内LC3-Ⅱ、p62和P97蛋白的表达量增加,且细胞内AH株的CCU显著增高。以MOI=200的AH株感染3D4/21细胞后,雷帕霉素或巴弗洛霉素A1处理细胞,细胞内LC3-Ⅱ、p62和P97的表达没有显著变化,而羟氯喹处理细胞,细胞内LC3-Ⅱ和p62的表达显著增高,P97的表达没有显著变化。用MOI=200的AH株感染细胞,与未处理组相比,雷帕霉素、巴弗洛霉素A1或羟氯喹处理组细胞内AH株的CCU无明显差异。结论:自噬促进胞内猪肺炎支原体的增殖。4.猪肺炎支原体对连接自噬体与溶酶体的栓系因子切割的研究目的:确定猪肺炎支原体是否能切割连接自噬体与溶酶体的栓系因子。方法:AH株感染3D4/21细胞,Western blot检测LC3-Ⅱ、STX17、SNAP29、PLEKHM1、ATG14、Rab7、VAMP8和P97蛋白表达情况。结果:与对照组相比,AH株感染组STX17、SNAP29和PLEKHM1的表达量下降,LC3-Ⅱ、ATG14、Rab7和VAMP8表达量显著增高。结论:猪肺炎支原体可能通过切割STX17、SNAP29和PLEKHM1蛋白,破坏STX17-SNAP29-VAMP8、LC3-PLEKHM1-HOPS-Rab7复合体,阻断自噬体与溶酶体的融合。