外二醇双加氧酶是一类广泛存在于自然界中,能够裂解多种芳烃类底物的酶。外二醇双加氧酶主要依赖金属离子来完成催化,能够有效除去环境中累积的有毒邻苯二酚类污染物质,对环境的修复具有积极意义。同时,外二醇双加氧酶可应用于工业加工、石油冶炼、生物制药等多个与芳香烃密切相关的领域,并清除其生产过程中产生的难以降解的芳香烃类物质,该过程是工业生产与排污治理的不可或缺的一个环节。双加氧酶Tc3516的基因来自高温单胞菌属Thermomonospora curvata,通过连接质粒pET-28a构建表达载体,并转化进入表达菌E.coli BL21（DE3）中表达蛋白。随后通过Ni²⁺-NTA亲和层析纯化目的蛋白,并进行性质表征。经检测,Tc3516的最适底物为3-甲基邻苯二酚,最适反应温度为50℃,最适反应缓冲液为50mM、pH为9的Gly-NaOH,在最适反应条件下测得酶的比活力为3.70 U/mg。为特异性提高该酶对3-甲基邻苯二酚的催化活力,对蛋白受体与底物配体进行了结构模拟与分子对接,并根据对接结果,在酶的活性位点附近根据“增大氨基酸疏水性,减少氨基酸残基的空间位阻”原则选定了6个氨基酸位点进行定点突变。获得构建成功的突变体后,对其性质表征发现,突变体的催化能力均有提高,其中D285A的突变结果最为显著,其催化效率相比于野生型提高了5倍多,且每个酶分子每分钟可以催化约51个底物分子。这也证实了基于分子对接的定点突变在一定程度上可以提高酶的催化活性。为了对活性最高的突变体进行应用方面的探究,本研究以SBA-15作为载体与D285A通过物理吸附固定化,以得到的固定化酶制作了连续流动反应器,以此来除去模拟污水中的3-甲基邻苯二酚。经实验优化,在温度为45℃,模拟污水流速为0.33 mL/s时,污水去除率可达到96%;反应器前三次通过模拟污水的清除率都达到了80%以上,处理十次后,对污染物的清除能力依然保留在60%。以固定化D285A为基础的连续流动反应器具有较高的催化效率与3-甲基邻苯二酚的去除率,可以进一步改良后扩大规模,在工业的大批量污水处理方面,具有积极的应用前景。