石斛(Dendrobium)最早记录于《神农本草经》,具有益胃生津、滋阴清热功能,是传统名贵中药。我国有74种和2变种石斛,其中,本文研究的细茎石斛(Dendrobium moniliforme(L.)Sw.)也是重要的药用石斛之一。案《范子计然》云,石斛,出六安。《名医别录》中“石斛生六安山谷水傍石上”。六安细茎石斛古有记载,六安是如今的安徽省六安市,六安石斛包括霍山石斛、铁皮石斛和细茎石斛,霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tanget SJCheng)和铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是名贵的石斛,市场上常出现细茎石斛冒充这两种石斛的现象,而细茎石斛的研究甚少,给品种鉴别带来了困难。因此,本课题对细茎石斛进行研究,为鉴别不同种的石斛提供研究基础。现有的细茎石斛的研究主要集中在多糖、生物碱和小分子化合物上,未见对于酚类化合物这一方面的研究。本课题组长期对石斛类药材进行研究,前期对细茎石斛不同产地的细茎石斛的指纹图谱进行比较,发现安徽产的细茎石斛的图谱特征性明显,出现两个峰值比例较大的2个吸收峰,可作为特征性成分与霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、美花石斛等石斛区别开来。本实验以安徽产的细茎石斛为研究对象,对细茎石斛的两个黄酮苷成分进行分离鉴定、质量评价研究,建立黄酮类成分的液相质谱联用(UHPLC/UV/MS)特征图谱及共有成分进行结构推测,为细茎石斛的质量控制提供研究基础和依据。目的:1、对安徽六安产的细茎石斛进行提取、分离、纯化的得到含量较大的细茎石斛黄酮苷,经过结构解析得到其结构,为开展细茎石斛的特征性黄酮苷成分含量测定研究提供基础;2、建立细茎石斛中牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]—β-葡萄糖苷的含量测定方法。3、建立细茎石斛中牡荆素-2"-O-鼠李糖苷和芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷的薄层色谱鉴别(TLC)方法。4、建立UHPLC/UV/MS特征图谱,分析共有峰和推测其结构,为细茎石斛的真伪鉴别和质量评价提供研究基础;5、观察细茎石斛牡荆素-2"-O-鼠李糖苷过氧化氢(H202)致大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)氧化损伤的保护作用,探索其抗氧化能力,为开展进一步的药理研究提供基础。方法1、运用溶剂提取法、AB-8大孔树脂法、羟丙基葡聚糖凝胶色谱法和高效制备液相法从细茎石斛中分离得到两个黄酮苷单体化合物,并运用紫外、氢谱、碳谱、质谱等手段鉴定了单体的结构;2、细茎石斛中牡荆素-2"-0-鼠李糖苷和芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷HPLC含量测定方法,色谱条件:以Agilent SB-Aq柱为色谱柱,以甲醇—1OmM乙酸铵为流动相,梯度洗脱,O～10min:25%→3O0%;10～15min:30%→33%;15～25min:33%→35%;25～40min:35%;流速为 1.0mL·min-1,检测波长为 340nm。3、采用薄层色谱法,分别对三批细茎石斛进行了鉴别,并在不同温度、湿度等条件下进行方法学验证。4、基于液相-质谱联用技术,建立细茎石斛UHPLC/UV/MS特征图谱,运用国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价条件系统软件进行分析,得到特征图谱共有模式,进行黄酮类UHPLC-ESI-MSn分析推测共有峰的结构。5、建立骨髓间充质干细胞(MSC)氧化损伤模型,运用MTT法检测牡荆素-2"-O-鼠李糖苷对H2O2致MSC氧化损伤的保护作用.结果1、分离鉴定得到细茎石斛黄酮类成分中含量较大的两个成分——牡荆素-2"-O-鼠李糖苷和芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷。2、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷对照品在0.344～5.16 μg与峰面积有良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为 102.8%,RSD 为 1.59%(n=6)。芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷在0.268～4.02 μ g与峰面积有良好的线性关系范围内呈良好线性关系(r=0.9998),平均回收率为99.4%,RSD为1.62%(n=6)。根据10批样品测定的结果,含细茎石斛牡荆素-2"-O-鼠李糖苷的质量分数在0.055%～0.136%范围内;芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷的质量分数在0.050%～0.117%范围内。3、在与对照品相应的位置上,三批细茎石斛样品均显相同颜色的两个斑点,且各方法分别在常温、低温、常湿、低湿条件下展开效果理想,两个特征斑点清晰圆整度较好,适用性较好。4、建立了细茎石斛的特征图谱;细茎石斛特征图谱中有5个共有峰,鉴定出4个结构,分别是牡荆素(1),牡荆素-2"-O-鼠李糖苷(2),芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷(3),异牡荆素(4)。5、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷对MSC细胞没有明显促增长作用;与空白对照组比较,H202组MSC细胞增殖能力明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),说明造模成功;与H2O2损伤组比较,牡荆素-2"-O-鼠李糖苷各质量浓度组MSC细胞增殖能力明显增强(P<0.01),说明牡荆素-2"-O-鼠李糖苷对H2O2损伤MSC均具有保护作用,且具有一定的量效关系。结论1、本研究首次从细茎石斛中分离得到牡荆素-2"-O-鼠李糖苷和芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷;2、建立的HPLC测定细茎石斛中牡荆素-2"-O-鼠李糖苷和芹菜素-6-C-[α-鼠李糖-(1→2)]-β-葡萄糖苷的含量测定方法,该方法该含量测定方法具有良好的准确性、重复性和稳定性,可用于细茎石斛的质量控制;3、细茎石斛药材的薄层方法斑点清晰,重现性好,无干扰,可作为细茎石斛质量标准的薄层鉴别方法。4、建立的液质特征图谱为细茎石斛的质量鉴别提供依据;5、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷不同质量浓度组对H2O2致MSC损伤均具有修复作用,说明牡荆素-2"-O-鼠李糖苷对H2O2致MSC损伤有一定的保护作用。