论文部分内容阅读
1目的本课题为国家自然科学基金——基于脑微透析技术的川芎-天麻升降佐制药性配伍研究(NO.81274107)的部分研究内容。前期完成了川芎-天麻不同剂量配伍水煎液、醇提液对硝酸甘油、刺激三叉神经节+附子致肝阳上亢偏头痛大鼠的药效学差异,并采用血液微透析技术结合高效液相色谱法(HPLC)研究了 口服给予不同剂量川芎-天麻提取物后天麻素(GAS)、天麻苷元(HBA)在该模型大鼠血透析液中的药动学规律,在此基础上,进一步采用血-脑同步微透析技术与HPLC结合的方法,从药动学角度研究不同比例天麻—川芎的配伍疗效,为临床应用提供参考。2方法2.1天麻素、天麻苷元的HPLC方法学建立色谱条件:色谱柱为 Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温 25℃,流速1ml/min,进样量10μl流动相为甲醇-0.05%磷酸(10:90),波长220nm。方法学考察:专属性考察:取空白人工脑脊液、GAS/HBA标准品溶液及给药后人工脑脊液分别按2.1液相条件检测。线性与检测限:精密称取GAS、HBA对照品,用人工脑脊液定容母液,对母液进行稀释得到7个浓度,测定并记录峰面积,得回归方程和标准曲线。精密度实验:分别配制GAS/HBA高、中、低三个浓度的混合对照品溶液,按2.1项下色谱条件连续进样5次,连续测定3d,记录峰面积并计算RSD值。2.2脑微透析的HPLC方法学建立及影响因素考察2.2.1流速对GAS/HBA体外相对回收率和相对损失率的影响将脑探针浸于浓度为103.23/51.48μg/ml的GAS/HBA混合对照品溶液中,用人工脑脊液在不同流速(1.0、1.5、2.0、2.5μl/min)下灌流,每个流速收集4份透析液,30μl/份,每换一个流速平衡30min,HPLC测定透析液中和原液中GAS/HBA的峰面积,按公式RR%=C透析液/C原液× 100%计算相对回收率:将脑探针浸于人工脑脊液中,用浓度为103.23/51.48μg/ml的GAS/HBA混合对照品溶液在不同流速(1.0、1.5、2.0、2.5μl/min)下灌流,每个流速收集4份透析液,304/份,每换一个流速平衡30min,HPLC测定透析液中和原液中GAS/HBA的峰面积,按公式RL%=(C原液-C透析液)/C原液× 100%计算相对损失率。2.2.2药物浓度对GAS/HBA体外相对回收率和相对损失率的影响将脑探针分别浸于浓度为 103.23/51.48、57.35/28.6、34.41/17.16、1 1.47/5.72μg/ml的GAS/HBA混合对照品溶液中,用人工脑脊液在2μl/min流速下灌流,每个浓度收集4份透析液,30叫/份,每换一个浓度平衡30min,HPLC测定透析液中及原液中GAS/HBA的峰面积,按公式RR%=C透析液/C 原液×100%计算出相对回收率(RR)。将脑探针分别浸于人工脑脊液中,分别用浓度为103.23/51.48、57.35/28.6、34.41/17.16、11.47/5.72μg/ml的GAS/HBA混合对照品溶液在2μl/min流速下灌流,每个浓度收集4份透析液,30μμ1/份,每换一个浓度平衡30min。HPLC测定透析液中以及原液中的GAS/HBA峰面积,按公式RL%=(C 原液-C透析液)/C 1 00%计算相对损失率。2.2.3 GAS/HBA体内相对损失率稳定性试验20%乌拉坦溶液(0.8ml/100g)麻醉大鼠,固定于脑立体定位仪上,植入脑探针(坐标:AP+0.2mm,ML+3.5mm,DV-3.5mm)后,平衡 0.5h,以 2(μl/min流速灌流,每隔30 min收集一份透析液,连续收集8小时。测定含药人工脑脊液和透析液中GAS和HBA的含量,计算脑探针的体内相对损失率。2.3川芎-天麻不同配比在肝阳上亢型偏头痛大鼠的血-脑同步微透析PK研究附子提取液的制备:称取制附子粗粉,加10倍水浸泡30min后加热回流提取2次,每次1h,过滤,合并滤液,减压浓缩为含生药2mg/ml药液。按2g/kg/d体重给予上述制备得到的附子提取液,连续灌胃21天,复制肝阳上亢证模型。将模型大鼠随机分为天麻组(GAS/HBA:183/24mg/kg)、川芎-天麻1:1组(GAS/HBA/FA/TMP:183/24/63/5.25mg/kg)、川芎-天麻 0.25:1 组(GAS/HBA/FA/TMP:183/24/15.94/1.31mg/kg),每组 6 只。血-脑探针植入方法:2%戊巴比妥钠麻醉大鼠(0.2ml/100g),剃去头部及两耳间毛发,固定于脑立体定位仪上,切开颅骨上的皮肤,以人字交叉点为坐标中心,埋下脑探针套管(坐标:AP+0.2mm,ML+3.5mm,DV-3.5mm),固定脑探针套管,取下大鼠,待其清醒能够自由活动,第二日埋入脉管探针,以20%乌拉坦溶液按0.8ml/100g剂量麻醉,大鼠仰卧位固定四肢,并剃去颈部左侧颈静脉周围的毛发,钝性剥离大鼠颈静脉,结扎远心端,插入脉管探针,取出头部脑探针套管的针头,插入脑探针,即完成血-脑探针的植入。完成血-脑探针的植入后随即给大鼠右肩皮下注射硝酸甘油(1Omg/kg)复制偏头痛模型,30min后按每组相应剂量灌胃给药,灌药后即刻收集透析液,按20min,40min,60min,90min.480min的时间规律收集透析液,连续收集8h。2.4川芎-天麻不同配比在正常及模型大鼠的血-脑同步微透析PK研究按“2.3”的方法造模,并将模型大鼠和正常大鼠随机分为天麻组(GAS/HBA:915/120mg/kg)、川芎-天麻 0.25:1 组(GAS/HBA/FA/TMP:915/120/79.7/6.55mg/kg)、川芎-天麻 1:1 组(GAS/HBA/FA/TMP:915/120/315/26.25mg/kg),每组3只,按2.3操作埋入血-脑探针,并接样检测。3结果3.1药后人工脑脊液中GAS、HBA与标准品溶液中GAS、HBA出峰时间基本一致,空白人工脑脊液无干扰,表明所建立的检测方法专属性良好。GAS 标准曲线:y=23660x+8574.8,R2=0.9998;HBA 标准曲线:y=45886x+10014,Rz=0.9991;在人工脑脊液中 GAS/HBA 于 0.28675-103.23/0.143-51.48(μg/ml)范围内线性关系良好。人工脑脊液中GAS/HBA高、中、低浓度日内精密度RSD分别为0.058%/0.110%、0.075%/0.467%、0.61%/0.933%;3 天日间精密度 RSD 分别为 0.764%/0.754%、1.517%/1.105%、2.691%/3.125%,表明仪器精密度良好。3.2随着流速增加,GAS和HBA的相对回收率和相对损失率有减小趋势;GAS在11.47～103.23μg/ml、HBA在5.72～51.48μg/ml范围内探针相对回收率与浓度无关;GAS和HBA的脑探针体内相对损失率在8h内稳定。3.3血中GAS的药动学结果:与天麻组比较:0.25:1组的达峰时间(Tmax)具有差异性(P<0.05);1:1组的达峰浓度(Cmax)增大,有极显著差异(P<0.01),AUC增加,有极显著差异(P<0.01)。与1:1组比较:0.25:1组的Cmax、AUC均减小,有极显著差异(P<0.01)。血中HBA的药动学结果:与天麻组比较,0.25:1组的Cmax增大,有极显著差异(P<0.01),AUC也增大,具有差异性(P<0.05),平均驻留时间(MRT)明显减少,有极显著差异(P<0.01),T1/2 明显缩短(P<0.05);1:1 组 Tmax、Cmax、AUC、MRT、T1/2均有极显著的差异(P<0.01)。与1:1组比较:0.25:1组的Tmax明显缩短(P<0.01)。脑中GAS的药动学结果:与天麻组比较,0.25:1组AUC明显增大(P<0.05),MRT也有所增加(P<0.05):与1:1组比较,0.25:1组的Cmax增大(P<0.05),AUC也显著增大(P<0.01),MRT增加,有显著性差异(P<0.05)。不同配比组HBA在脑中的浓度未得到完整的药动学参数。3.4血液中GAS结果:在模型组中,与天麻组相比,0.25:1组和1:1组的Tmax和Cmax均增加,T1/2均减小,0.25:1组的MRT减小,1:1组的MRT增大;0.25:1组与1:1组比较,1:1组的Tmax、Cmax减小,AUC、MRT、T1/2均增大。在正常组中,与天麻组比较:0.25:1组和1:1组的Tmax、Cmax、AUC和MRT均减小,加入川芎后,GAS的吸收较少,消除减慢。血液中HBA结果:在模型组中,与天麻组相比,0.25:1组和1:1组Tmax、Cmax、AUC均增加,0.25:1组的MRT、T1/2均减小,而1:1组的MRT、T1/2均增加。0.25:1组与1:1组比较,Tmax、Cmax、AUC均减小,MRT、T1/2均增大在正常组中,与天麻组比较,0.25:1组Tmax、AUC、MRT、T1/2均增大,Cmax减小,1:1组的Tmax、Cmax均增大,与0.25:1组相反,1:1组AUC、MRT、T1/2均减小;0.25:1组与1:1组比较,Tmax、AUC、MRT、T1/2均减小,脑中GAS结果:在模型组中,与天麻组相比:0.25:1组和1:1组的的Tmax、Cmax、AUC均增大,T1/2、MRT均减小;0.25:1组与1:1组比较,1:1组的Tmax增大,Cmax、AUC均减小,MRT、T1/2基本不变,在正常组中,与天麻组相比,0.25:1组和1:1组的Tmax、Cmax、AUC、MRT均减小,T1/2均增大;0.25:1组与1:1组相比,Tmax、AUC、MRT减小,T1/2增大。脑中HBA结果:在模型组中,与天麻组相比,0.25:1组和1:1组的Tmax和Cmax均增大,0.25:1组AUC减小,1:1组的AUC增大。在正常组中,与天麻组相比,0.25:1组和1:1组的Tmax增大,Cmax、AUC、MRT、T1/2均减小。4结论4.1 HPLC仪器精密度良好,对于GAS、HBA检测专属性强,可进行接下来HPLC联合微透析技术的方法学考察。4.2在固定灌流速度、一定药物浓度范围内RR稳定,体内RL稳定性良好,此检测方法可作为川芎-天麻配伍在体药动学的检测方法。4.3川芎可以促进GAS的吸收和HBA的吸收和消除;川芎-天麻0.25:1组的GAS透过血脑屏障的能力最优。4.4在模型大鼠中,川芎促进GAS、HBA的吸收,且呈双向调节作用;对于正常大鼠,加入川芎不利于GAS的吸收。在模型大鼠中,川芎促进GAS透过血脑屏障。在正常大鼠中,川芎不利于GAS、HBA透过血脑屏障。