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量子点(QuantumDots,QDs)作为一种新型荧光纳米材料,由于其独特的优点近年来备受关注,在许多领域都有广泛应用。量子点具有激发光谱宽且连续分布,而发射光谱窄而对称,颜色可调,光化学稳定性高,荧光寿命长等优越的荧光特性,是一种理想的荧光探针。国内外许多研究专注于量子点制备、修饰等方面,期望实现对量子点的尺寸、结构、性能、分散度的调控,降低其毒性,以使其能更好的应用于生命科学领域。在生命科学领域,荧光成像技术是一种重要的手段。但常用的有机染料易于光漂白,无法对标记物进行长期的追踪及观察标记物的动力学过程。荧光蛋白的出现可以在一定程度上解决这一问题,但需使用基因工程技术制备可表达融合蛋白的质粒,进行细胞培养、基因转染等一系列操作,不易普及。量子点的出现可以很好地解决上述问题。
病毒等重要病原体能够对人类健康造成严重威胁。在活细胞内对病毒的生命活动过程进行高灵敏研究是极具创新且备受关注的课题。利用新型的纳米探针量子点与病毒实现可控组装,发展一系列病毒的生物大分子和病毒粒子的标记新方法,对在揭示病毒的侵染机制、促进了纳米技术和功能性纳米结构器件的生物学应用方面有着重大意义。由于病毒引发的宿主应答是机体对抗病毒感染的核心环节。从认识的系统性角度出发,同时为了客观、科学地将纳米材料应用于生物学过程研究,研究宿主对量子点标记病毒的应答行为及机理十分必要。
细胞因子是由多种细胞产生,并具有广泛的调节细胞功能作用的多肽分子。细胞因子不仅作用于免疫系统和造血系统,还能够广泛作用于神经、内分泌系统,对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能也有相应生物效应。检测细胞因子及其受体的水平已成为生物学研究的一个重要的方面。细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义,它有助于阐明分子水平的免疫调节机理,有助于疾病的预防、诊断和治疗,特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等疾病,并收到良好疗效,具有非常广阔的应用前景。因此,作为活细胞对抗量子点标记病毒侵染过程的宿主应答重要环节,对细胞因子分泌水平变化的研究有着重要意义。
现阶段研究中,人们多关注量子点标记生物大分子及活细胞过程引起的宿主应答、量子点标记病毒对病毒毒性的影响及各种未标记示踪的病毒侵染细胞或活体过程中引起的细胞因子分泌水平。而将量子点标记的病毒用以侵染活细胞、以实现动态监测病毒行为过程中,对活细胞引起的细胞因子分泌水平的宿主应答研究工作却鲜有报道,本文在此方面开展的工作创新且具有实际意义。探讨量子点标记病毒在体内引发的应答行为,为评价量子点的生物效应、量子点标记对病毒本身行为的影响、研制适用于活体示踪的量子点提供重要依据。
汞离子作为毒性极高的重金属离子,具有易被人体吸收且不易降解的特点,对人类和环境都有长远的危害,因此其检测方法的创新和改进一直是人们关注的焦点。牛血清白蛋白(Albuminfrombovineserum,BSA)稳定的纳米金簇表面带有一价金离子(Au+),而一价金离子可以与二价汞离子(Hg2+)高效特异性的结合作用从而选择性抑制纳米金簇的模拟酶活性。基于此现象并与3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)-H2O2显色反应相结合,我们建立了通过Hg2+离子抑制纳米金簇的模拟酶活性从而建立定量检测Hg2+的方法。本论文的主要研究工作如下:
(1)以链霉亲和素联接的量子点通过生物素-亲和素的经典生物学反应标记禽流感病毒H9N2,研究标记后病毒对宿主细胞人肺上皮癌细胞(A549)分泌干扰素γ(IFN-γ)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)水平的影响。验证生物素(biotin)浓度对病毒毒性影响,考察量子点标记病毒病毒滴度变化,为细胞因子测定水平结果的可靠性提供保障。讨论不同时间、不同浓度量子点标记病毒侵染A549细胞的宿主应答,发现量子点标记病毒对A549细胞分泌三种细胞因子水平均有影响。
(2)基于量子点标记病毒侵染A549细胞的宿主应答的研究,利用同样的标记物和标记策略,考察其对一种单核巨噬细胞引起的宿主应答。以安全的biotin浓度,使H9N2病毒生物素化,与联接有链霉亲和素的量子点结合后,侵染小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7。随着时间进程及浓度变化,该种细胞的IFN-γ、IL-6、IL-12的分泌水平出现变化。结合A549细胞的实验结果,得到该标记策略在细胞因子分泌水平层面的宿主应答结论。
(3)牛血清白蛋白(BSA)-金簇作为一种新出现的纳米材料,具有极好的荧光及模拟酶活性。基于Hg2+可以选择性抑制BSA-金簇的过氧化物酶模拟酶活性从而导致其催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢(H2O2)显色反应能力降低,建立了目视化半定量和吸光光度法定量检测Hg2+的新方法。