【摘 要】
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S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,简称SAM）,是生物体内重要的甲基供体,在细胞生长过程中起着重要的作用。本研究通过对甲硫氨酸腺苷转移酶库的筛选,发现脆弱类杆菌（Bacteroides fragilis）来源的甲硫氨酸腺苷转移酶（Methionine adenosyltransferase,简称MAT）Bf MAT拥有良好的产物耐受性,但其催化活力不高,不能满足工业化生产
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S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,简称SAM）,是生物体内重要的甲基供体,在细胞生长过程中起着重要的作用。本研究通过对甲硫氨酸腺苷转移酶库的筛选,发现脆弱类杆菌（Bacteroides fragilis）来源的甲硫氨酸腺苷转移酶（Methionine adenosyltransferase,简称MAT）Bf MAT拥有良好的产物耐受性,但其催化活力不高,不能满足工业化生产的需求。因此,通过分子改造获得了活力提高突变体。主要研究内容和结果如下:（1）Bf MAT突变位点的筛选。采用半理性设计策略,基于Alpha Fold对Bf MAT进行蛋白质结构建模,并使用Discovery Studio进行分子对接,通过分析对接结果,筛选获得底物5（?）附近的共16个关键氨基酸位点Val39,Ala40,Glu42,Glu55,Gln98,Ile102,Asp118,Thr267,Gly268,Ile271,Gly284,Gly285,Ala286,Lys290,Lys294,Asp296。通过高通量方法的筛选,得到了活力提高的单突变体E42M、E42R、E42C、E55L和K290I。随后将这些位点进行组合突变,发现E55L与其他位点存在协同作用,而E42与K290位点相互具有拮抗作用。由此获得了活力提高的双突变体E42M/E55L、E42R/E55L、E42C/E55L和E55L/K290I并进一步筛选获得三突变体E42M/E55L/K290I、E42R/E55L/K290I和E42C/E55L/K290I,其活力分别为WT的2.13倍、2.10倍和2.26倍。（2）Bf MAT突变体酶学性质的表征。发现突变体E42M/E55L/K290I、E42R/E55L/K290I和E42C/E55L/K290I的最适反应p H相对于WT的最适p H从8.0下降到了7.5,而最适温度则均为60 oC。动力学参数测定显示,三突变体E42M/E55L/K290I和E42C/E55L/K290I的kcat/Km值分别为WT的4.22和7.81倍;而E42R/E55L/K290I由于其Km值相对于WT无明显降低导致其催化效率提升不明显。在10 m M ATP和甲硫氨酸反应中发现,Bf MAT具备良好的产物耐受性,在反应12小时后,E42M/E55L/K290I、E42R/E55L/K290I和E42C/E55L/K290I的转化率为30.40%、33.03%和35.52%,较WT分别提高了11.4%,21.0%和30.2%。（3）Bf MAT突变体分子对接与分子动力学模拟。基于分子对接结果,突变体催化效率提高的原因主要归因于ATP与底物口袋的静电作用力的减弱,更有利于ATP进入底物口袋。而突变体E42R/E55L/K290I相对于其他两个三突变体E42M/E55L/K290I和E42C/E55L/K290I的底物亲和力没有明显提高,这是由于带正电的Arg对底物ATP具有静电吸引作用,而该作用力影响了ATP以正确的构象进入底物口袋。最后,通过对Bf MAT WT及突变体E42M/E55L/K290I、E42R/E55L/K290I和E42C/E55L/K290I与底物ATP的短程非键作用力与自由能的分析,验证了突变体对ATP的结合较WT更加稳定。结果表明,Bf MAT是一种具有应用开发潜力的生物催化剂,对其进行分子改造获得的突变体对工业生产具有一定的应用价值。
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