漆酶（EC 1.10.3.2,Laccase）是一种多铜氧化酶,可以氧化包括酚类、非酚类和无机化合物等在内的多种底物。目前,漆酶已广泛用于食品加工、造纸制浆、纺织和生物修复等领域。为提高漆酶的发酵生产水平及应用效果,本研究通过核糖体结合位点（RBS）替换、N端编码区理性设计、共表达裂解蛋白及培养条件优化强化了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis漆酶（Cot A）在大肠杆菌Escherichia coli中分泌表达,并基于理性设计提高了其热稳定性。主要研究结果如下:（1）Cot A在E.coli中的胞内表达。将基于E.coli密码子偏好性合成的Cot A基因克隆至p ET24a-Cot A并转化至E.coli BL21（DE3）,得到重组菌Cot A-RBS。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于20℃诱导28 h,Cot A-RBS胞内Cot A酶活达到448.96U·L-1。通过RBS Calculator及RBS Library Calculator设计得到5个具有不同翻译起始速率（7695.43-882376.36）的RBS。其中,使用RBS5（翻译起始速率最小）的重组菌Cot A-RBS5胞内酶活最高(1198.12 U·L-1),较优化前提高1.67倍。基于蛋白N端编码区序列参数与其表达量统计学的统计模型优化Cot A前10个氨基酸的编码序列,构建得到重组菌株Cot A-RBS5-N1,其胞内酶活达到1632.3 U·L-1,较优化前提高1.36倍。最后通过优化IPTG浓度、Cu2+浓度、诱导菌体浓度和诱导温度,使胞内Cot A达到7132.99U·L-1,较优化前提升3.37倍。（2）Cot A在E.coli中的胞外表达。胞外酶活分析显示,在上述最佳诱导表达条件下,Cot A-RBS5-N1在24 h时胞外酶活达到2616.31 U·L-1。由于Cot A并未融合分泌信号肽且菌体生长缓慢,Cot-RBS5-N1在发酵后重组菌株可能发生了裂解。为提高Cot A胞外表达水平,分别考察了山梨醇、甘氨酸、曲拉通X-100和吐温-80对Cot A胞外表达的影响。结果显示,添加10 g·L-1山梨醇可以使Cot A-RBS5-N1胞外酶活在诱导20 h后达到5540.83 U·L-1,较优化前提高1.12倍。在此基础上,将编码裂解蛋白E的质粒p CDF-Duet-E转化至Cot A-RBS5-N1得到重组菌株Cot A-RBS5-N1-E,并优化了裂解蛋白E诱导剂阿拉伯糖的添加条件。当Cot A-RBS5-N1-E的OD600达到6时,添加2 mmol·L-1的阿拉伯糖使胞外酶Cot A达到6488.75 U·L-1。（3）Cot A的热稳定性改造。基于研究室前期开发的Rosetta Cartesian＿ddg脚本对Cot A进行全序列脯氨酸扫描,对折叠自由能下降最多的15个突变体进行表达和热稳定性分析。结果表明,80℃条件下水浴30 min后,突变体G321P残余酶活由野生型Cot A的73%提高至85%。同时,G321P比酶活为51.64 U·mg-1,较Cot A的比酶活(53.96U·mg-1)下降不明显。基于Rosetta Supercharge对Cot A分子表面24个位点进行虚拟突变（将表面极性或碱性氨酸残基替换为酸性氨基酸）,使Cot A表面净电荷达到-46。经Rosetta Cartesian＿ddg分析去除高折叠能突变体,设计得到含9个点突变的组合突变体Cot A-Mut。热稳定性分析显示,Cot A-Mut于80℃处理30min的残余酶活提高至91%,但其比酶活为3.22 U·mg-1。分子动力学分析表明,氢键和离子相互作用的增加可能分别是G321P和Cot A-Mut提高的原因。