背景：　　对于任何传染性疾病的出现，能及时检测和鉴定病原体是有效控制疫情并选择合理治疗方案的关键。随着生物技术的高速发展，以核酸扩增和核酸序列分析为代表的分子诊断/检测技术在病原体鉴定和确认中越来越多地发挥了重要作用。近年来突发公共卫生事件处置中未知病原体大量筛查、临床诊断中非特异症状相关的病因确定、个体化医疗中易感基因筛查等多样化的实际需求又提出了对一份样本中存在的多个靶标进行同步检测的要求，即多重生物检测。目前，常规多重检测存在通量不高和成本高（如多重定量PCR）或自动化程度不高（如多重PCR结合普通琼脂糖凝胶电泳分析）的不足，因此，建立一种高灵敏度和特异性高通量和低成本的准确鉴定病原及其突变的技术，对提高我国应对突发传染病的能力和控制传染病的流行有重大意义。　　目的：　　建立基于熔解熔解曲线分析和QIAxcel毛细管电泳仪的两种新型一步法多重PCR检测技术。应用熔解曲线分析多重PCR检测技术可以在两管中同时检测六种常见的食源性细菌，包括:沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌和致泻性大肠杆菌，四管中同时检测十二种腹泻病原体，包括:六种腹泻病毒和六种腹泻细菌，还可以结合ARMS-PCR对流感病毒耐药位点进行突变检测。应用QIAxcel毛细管电泳仪多重PCR检测技术可以实现单管同时检测六种人类冠状病毒，包括:HCoV-NL63、HCoV-229E、SARS-CoV、 HCoV-OC43、MERS-CoV和HCoV-HKU1，两管同时检测十三种腹泻病原体，包括:六种腹泻病毒和七种腹泻细菌。本方法拟在全国省市疾控中心推广应用于常见食源性细菌、常见腹泻病原体和人类冠状病毒的常规监测。　　方法：　　本研究建立的两种检测新技术分别应用两种不同的分析方法:基于熔解曲线分析和基于QIAxcel毛细管电泳仪分析方法。针对检测病原体的保守区及部分病毒的分型区序列设计特异性引物，并对常见的细菌及病毒引物进行验证，熔解曲线分析技术的原理是在PCR扩增反应体系中加入荧光染料，PCR扩增结束后运行一步熔解曲线反应程序。不同病原体DNA序列因其片段长度大小和GC含量的差异，熔解温度Tm值会各不相同，即可通过不同熔解曲线区分不同的病原体扩增片段。设计6对特异性引物于两管内扩增检测六种常见的食源性细菌;12对特异性引物于四管中扩增检测十三种腹泻病原体;对流感病毒耐药位点设计2对特异性引物结合ARMS-PCR检测野生型和突变型两种不同的基因型。QIAxcel毛细管电泳仪分析技术的原理是利用不同的扩增片段大小进行区分不同的病原体，因此设计6对特异性引物于一管中检测六种人类冠状病毒，13对特异性引物于两管中检测十三种腹泻病原体。评价两种检测新技术的灵敏度和特异性，运用人工污染样品或临床样品进行实际验证，并与实验室常用检测标准的检测结果进行比较，检测结果不一致的标本用测序和另选取特异性检测基因设计引物扩增并测序的方法进行再验证，评价两种检测新技术的临床运用情况。　　结果：　　成功建立了一种基于熔解曲线分析的多重PCR检测技术。　　1.六种常见的食源性细菌纯培养中同时检测出的灵敏度可以达到102CFU/ml，人工污染牛奶的实验中六种病原体同时检出的灵敏度可以达到105CFU/ml的水平。　　2.十二种腹泻病原体的检测中多引物单模板和多引物多模板检测六种腹泻病毒的灵敏度均为50拷贝/反应，六种腹泻细菌的检测灵敏度为140-500CFU/ml。122份临床样品的检测结果与实验室常用检测标准的检测结果比较显示，四管多重法有5例轮状病毒A型多检，2例腺病毒F型多检，1例诺如病毒Ⅰ型漏检。多检样品采取测序和另选取特异性检测基因设计引物扩增并测序的方法进行再验证后四管多重法结合熔解曲线检测结果与测序相符合。　　3.结合ARMS-PCR对流感病毒耐药位点的检测，多重检测体系单模板检测下限均可以达到1.0×102copy/μ l。多重检测体系多模板在1.0×103copy/μl水平时可同时检测到突变型和野生型两种混合模板。　　成功建立了一种基于QIAxcel毛细管电泳仪的多重PCR检测技术。　　1.六种人类冠状病毒的检测结果显示一管多重检测体系在检测单个病毒时灵敏度能达到10-100 copy/μl。临床样本平行验证结果与常用的单一HCoV检测的荧光定量RT-PCR法及巢式PCR法一致。　　2.十三种腹泻病原体的检测结果显示两管多重检测体系与四管熔解曲线分析多重PCR检测熔解结果比较除5例诺如病毒Ⅱ型漏检外，其他检测结果基本一致。　　结论：　　成功建立了基于熔解曲线分析和QIAxcel毛细管电泳仪分析的两种新型一步法多重PCR检测技术，具有高灵敏度、高特异性、高通量（毛细管电泳仪分析）并且成本低（熔解曲线分析）的优势，有助于提高我国对食源性细菌、腹泻病原感染的常规检测/监测能力，并对控制传染病的流行有重要意义。