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目的:邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（Di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP）属于增塑剂,存在于日常生活中可接触到的多种物品中。但接触过多的DEHP会通过使睾丸组织发生退行性变以及降低精子质量等方式影响男性生育能力,并且当儿童时期过多接触这种物质产生的影响可能会持续到成年时期。近年来的研究发现,mRNA的N~6-甲基腺苷（N~6-methyladenosine,m~6A）修饰在生殖系统中发挥很重要的作用。m~6A修饰的识别蛋白YTHDC2在睾丸中表达程度较高,并且在精子发生过程中起重要作用。因此本课题旨在观察青春期前雄性大鼠接触DEHP后带来的器质性改变以及成年后雄性大鼠精子发生的变化,并探究YTHDC2在Notch信号通路异常中发挥的作用。为揭示青春期前雄性大鼠DEHP暴露对青春期睾丸组织器质性病变及成年后精子质量的影响提供理论依据。研究方法:选用48只清洁级出生后第21天（Postnatalday21,PND21）断奶的雄性SD大鼠。将其按体重随机分为4组,每组12只。采用灌胃的方式进行染毒。第1组为对照组,给予玉米油;第2-4组为低、中、高剂量染DEHP组,分别按照5、50、500 mg/kg剂量给予溶于玉米油中的DEHP。每三天记录体重及肛门生殖器距离。连续染毒12天后,将每组大鼠分为两部分,第一部分共4只,接受常规饲料饲养,直至60天。第二部分共8只,染毒结束后立即取材。第一部分养至60天后,分离附睾组织。将双侧附睾组织各剪成3段分别放入37℃生理盐水中使精子自行游离,将精子悬液用于精子计数和形态的观察。第二部分染毒后每组取6只大鼠,分离睾丸及附睾组织称重并提取蛋白质和mRNA。每组另取2只,用4%的多聚甲醛灌流。对睾丸进行固定包埋,切片之后进行糖原染色、HE染色等观察组织结构改变。体外培养小鼠精母细胞系（GC-2spd）,给予精母细胞系0、100、200、400μmol/L的DEHP,观察其对细胞活力、形态学、YTHDC2及Notch1的mRNA及蛋白表达水平、细胞凋亡情况和YTHDC2及Notch1表达位置的影响。采用质粒转染方式构建YTHDC2过表达的细胞模型,检测其凋亡情况及Notch1的蛋白表达和mRNA水平情况变化。使用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断Notch信号通路,再次检测细胞凋亡水平。结果:1.体内实验发现,DEHP可使体重和AGD增长相对缓慢。在第30和33天称量体重时,500 mg/kg DEHP组较对照组相比差异明显。ELISA结果表明血清睾酮含量随染毒剂量增加有逐渐减少趋势,但其差异无统计学意义。2.成年后大鼠500 mg/kg DEHP组精子数量明显下降,并出现无头,无尾,双头畸形和尾部卷曲等畸形的精子。精子畸形率逐渐升高。染毒后大鼠睾丸及附睾组织的脏器系数均降低,随着染毒剂量的增加,500 mg/kg DEHP组大鼠睾丸脏器系数较对照组相比差异明显。50和500 mg/kg DEHP组大鼠附睾脏器系数与对照组相比差异明显。HE染色和糖原染色结果发现,DEHP会造成睾丸组织损伤、生殖细胞数量减少。与对照组相比,中、高剂量染毒组大鼠睾丸的曲细精管萎缩,有脱落的生殖细胞碎片和巨噬细胞。DEHP会降低睾丸中YTHDC2及Notch1 mRNA表达和蛋白水平。其中50和500 mg/kg DEHP组Notch1蛋白水平较对照组相比差异明显。Notch1 mRNA表达和YTHDC2 mRNA表达及蛋白水平均为500 mg/kg DEHP组较对照组相比下降较明显。3.体外实验中发现染DEHP后会使GC-2spd细胞形态改变。随染DEHP剂量的增加,细胞数量变少且形状变圆,逐渐失去原有细胞状态。流式细胞术检测结果发现,染DEHP后会增加GC-2spd细胞凋亡水平。200μmol/L和400μmol/L DEHP组的细胞凋亡率较对照组相比差异均有统计学意义。在单独施加Notch信号通路的抑制剂DAPT干预之后,也会使GC-2spd细胞凋亡,且凋亡水平与400μmol/L DEHP组相似。但DAPT和DEHP联合干预组凋亡水平有所升高。免疫荧光染色结果可看出在GC-2spd细胞中YTHDC2和Notch1共表达的。DEHP也同样会降低GC-2spd细胞中YTHDC2及Notch1 mRNA表达和蛋白水平。三个剂量DEHP组中YTHDC2蛋白水平与对照组相比差异差异明显。400μmol/L DEHP组Notch1蛋白水平与对照组相比差异差异明显。而对于GC-2spd细胞中YTHDC2以及Notch1 mRNA的表达水平来看,400μmol/L DEHP组相较于对照组变化最为显著。4.在过表达YTHDC2的GC-2spd细胞模型中,实验结果显示,OE-NC+DEHP组较OE-NC组相比Notch1表达量明显下降。OE-YTHDC2+DEHP组Notch1 mRNA表达和蛋白含量与OE-NC+DEHP组相比有所提升,差异有统计学意义。对过表达YTHDC2的GC-2spd细胞模型做流式细胞术实验,结果表明OE-NC组和OE-YTHDC2组细胞凋亡水平相似。OE-YTHDC2+DEHP组细胞凋亡水平较OE-NC+DEHP组有所降低。OE-YTHDC2+DEHP+DAPT组细胞凋亡水平较OE-NC+DEHP+DAPT组也同样有所降低。结论:1.青春期前期接触DEHP可以使雄性大鼠睾丸组织损伤并影响成年后的精子质量。2.DEHP可以降低睾丸和GC-2spd细胞中的YTHDC2以及Notch1的表达。3.DEHP可以通过降低睾丸中的YTHDC2表达进而减低Notch1水平,从而导致精母细胞凋亡进而导致精子发生异常。