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研究目的软骨损伤和软骨下骨硬化是骨关节炎（OA）发病过程中的重要表现,有研究表明,在被OA状态下的软骨细胞（AC）诱导后,软骨下骨祖细胞（SBPC）可发生表型改变及Wnt/β-catenin信号通路的激活,进而导致软骨下骨硬化。但其具体的作用机制仍未明确。本文拟通过细胞层面的体外实验、组织层面的体内动物实验以及分子层面的机制研究,来探索并验证OA状态下的软骨细胞（OA-AC）诱导SBPC表型改变的关键信使,进而分析被诱导后的SBPC中Wnt/β-catenin信号通路的激活与SBPC表型改变的关系,最后分析并验证其在OA进展中介导软骨下骨病理改变的具体机制。研究方法及结果第一部分:体外实验研究软骨细胞外泌体调控软骨下骨祖细胞表型及Wnt/β-catenin信号通路的改变研究方法:（1）通过物理建模方法构建新西兰大白兔膝关节OA模型,提取并鉴定正常软骨细胞（N-AC）、OA状态的软骨细胞（OA-AC）、正常软骨下骨祖细胞（N-SBPC）和OA状态的软骨下骨祖细胞（OA-SBPC）;（2）用CKK-8法、Western blot及q RT-PCR法检测N-SBPC和OA-SBPC的增殖能力、成骨能力相关蛋白Ⅰ型胶原蛋白（Co L-1）、碱性磷酸酶（ALP）及矿化能力相关的骨涎蛋白（BSP）等表型变化,以及Wnt/β-catenin信号通路中重要蛋白β-catenin和下游相关代谢效应基因矮小相关转录因子2（Runx-2）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）、骨形成蛋白2（BMP-2）及解聚蛋白样金属蛋白酶5（ADAMTS-5）的表达情况;（3）分别提取并鉴定N-AC分泌的外泌体（N-AC-Exo）和OA-AC分泌的外泌体（OA-AC-Exo）后,分别将N-AC-Exo、OA-AC-Exo、N-AC分泌的富含细胞因子的去外泌体上清液（NAC-CKs）及OA-AC分泌的富含细胞因子的去外泌体上清液（OA-AC-CKs）加入NSBPC中共培养,用CKK-8法、Western blot及q RT-PCR法检测SBPC的增殖能力、Co L-1、ALP及BSP等表型变化,和Wnt/β-catenin信号通路中重要蛋白β-catenin和下游相关代谢效应基因Runx-2、MMP-13、BMP-2及ADAMTS-5的表达变化,进一步明确及验证AC-Exo是否是改变SBPC表型的关键信使,以及在该过程中发生激活的Wnt/β-catenin信号通路的情况。研究结果:（1）首先通过物理建模的方法成功构建了新西兰大白兔膝OA模型,进而成功提取了N-AC/OA-AC和N-SBPC/OA-SBPC,并通过流式分析法和成骨分化诱导试验等验证所提取的SBPC符合国际干细胞治疗学会（ISCT）提出的相关标准。（2）在评估了N-SBPC和OA-SBPC的表型差异后,我们发现OA-SBPC的增殖能力和成骨能力（Co L-1、ALP的表达）较N-SBPC明显提高,但是其矿化能力（BSP的表达）较N-SBPC有下降,同时我们也发现了OA-SBPC中Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白β-catenin和下游相关代谢效应基因的表达增强,提示该信号通路的激活。（3）在分别将N-AC-Exo、OA-AC-Exo、N-AC-CKs及OA-AC-CKs加入N-SBPC中共培养后,我们发现OA-AC-Exo组发生了N-SBPC表型向OA-SBPC表型转化,以及Wnt/β-catenin信号通路的激活,而其他三组并无明显改变,在细胞层面上提示OA-AC-Exo可能是OA-AC诱导N-SBPC表型向OA-SBPC表型改变、及激活其中Wnt/β-catenin信号通路的关键信使。结论:（1）建立了OA动物模型并成功提取了符合ISCT相关标准的SBPC。（2）发现了OA-SBPC的增殖能力和成骨能力较N-SBPC明显提高,但矿化能力下降,且存在Wnt/β-catenin信号通路激活的情况。（3）在细胞层面上验证了OA-ACExo是影响SBPC表型改变和激活Wnt/β-catenin信号通路的重要信使。第二部分:体内实验研究软骨细胞外泌体诱导软骨下骨的病理改变研究方法:（1）通过采用在正常新西兰大白兔膝关节软骨下骨钻孔注射OAAC-Exo/N-AC-Exo/Saline的方法进行建模,分别在术后6周和12周获取各组股骨髁标本,对大体标本进行观察和OARSI评分。（2）将上述标本制作石蜡切片,通过HE染色评估细胞情况及相关结构的变化、番红固绿染色评估软骨及软骨下骨情况、Mason染色评估软骨和软骨下骨胶原纤维的改变情况、免疫组化评价软骨下骨中I型和II型胶原的表达情况,来进一步通过组织水平的体内实验明确OA-AC-Exo对软骨下骨组织的诱导情况。（3）通过提取软骨下骨组织中的蛋白和核酸来进一步检测Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白β-catenin和下游相关代谢效应基因Runx-2、BMP-2、MMP-13及ADAMTS-5的表达变化。从而在组织水平的体内实验上进一步验证OAAC-Exo对SBPC的诱导作用,以及Wnt/β-catenin信号通路的激活情况。研究结果:（1）分别在术后6周和12周,获取OA-AC-Exo组、N-AC-Exo组及PBS对照组的股骨髁标本,研究发现OA-AC-Exo组软骨下骨随着时间的推移,可发生进行性的相关细胞增殖能力提高,部分结构出现进行性的致密、孔隙减少,局部出现少量椭圆形或圆形骨赘,部分骨小梁断裂,哈弗管大量消失,I型胶原和II型胶原等减少的情况。而N-AC-Exo和Saline的对照组并无明显变化。（2）我们对软骨下骨组织中的蛋白和核酸进行了进一步的鉴定,研究结果发现,OA-AC-Exo组中Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白β-catenin和下游相关代谢效应基因Runx-2、BMP-2、MMP-13及ADAMTS-5的表达较其他组均有显著增强,而N-AC-Exo组和Saline对照组并无明显变化。结论:发现了OA-AC-Exo可导致软骨下骨结构改变及Wnt/β-catenin信号通路的激活,从组织水平的体内实验角度进一步验证了OA-AC-Exo是诱导软骨下骨病理改变和激活Wnt/β-catenin信号通路的重要信使。第三部分:软骨细胞外泌体介导软骨下骨祖细胞Wnt/β-catenin信号通路在骨关节炎进展中的机制研究研究方法:（1）通过Wnt/β-catenin的特异性激动剂SKL2001/抑制剂XAV-939分别上调和下调SBPC中Wnt/β-catenin信号通路,并与OA-AC-Exo组对照,用CKK-8法、Western blot及q RT-PCR法检测SBPC的增殖能力、Co L-1、ALP及BSP的表达,和Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白和下游相关代谢效应基因的表达变化来验证该信号通路的激活是否是导致SBPC表型改变的关键因素。（2）分别裂解OA-AC-Exo中核酸和蛋白质后与N-SBPC共培养,用Western blot及q RT-PCR法检测SBPC的Co L-1、ALP及BSP等表型变化,和Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的表达变化,来鉴别是OA-AC-Exo中的何种成分诱导了SBPC表型的改变及Wnt/β-catenin信号通路的激活。（3）通过高通量测序分析OA-AC-Exo与N-AC-Exo中微小核糖核酸（mi RNA）的差异表达情况,筛选出差异表达明显的重要mi RNA。（3）分别转染特异性的mi RNA mimics和mi RNA inhibitor进入N-SBPC,以Western blot及q RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白及其上游重要调节因子骨硬化蛋白（SOST）、Dickkopf相关蛋白1（DKK-1）、R-spondin家族蛋白2（Rspo2）的表达情况,验证OA-AC-Exo发挥调控作用的mi RNA及相关机制。研究结果:（1）SKL2001组和OA-AC-Exo组中的SBPC的增殖能力和成骨能力（Co L-1、ALP的表达）较其他两组明显提高,但是其矿化能力（BSP的表达）较另外两组有下降,验证了Wnt/β-catenin信号通路的激活是诱导SBPC表型改变的重要因素。（2）分别裂解OA-AC-Exo中的蛋白质和核酸并作用于N-SBPC后,发现蛋白质裂解组和OA-AC-Exo组SBPC的成骨能力（Co L-1、ALP的表达）以及β-catenin蛋白的表达情况较其他两组明显提高,但是其矿化能力（BSP的表达）较其他两组有下降,证明核酸是OA-AC-Exo激活Wnt/β-catenin信号通路的重要成分。（3）通过高通量测序筛选出了OA-AC-Exo和N-AC-Exo差异性表达最显著的mi RNA为mi R?335?5p。（4）通过mi R?335?5p mimics及mi R?335?5p inhibitor分别转染N-SBPC,在分析了Wnt/β-catenin信号通路上游调控因子的表达后,我们发现mi R-335-5p mimics组和OAAC-Exo中在β-catenin蛋白的含量升高的同时,DKK-1的表达出现下调,表明导致mi R-335-5p可能是通过下调DKK-1,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,从而诱导NSBPC表型向OA-SBPC的表型发生转化。结论:（1）Wnt/β-catenin信号通路的激活是诱导SBPC表型改变的重要因素。（2）mi R?335?5p是OA-AC-Exo激活Wnt/β-catenin信号通路的重要成份之一。（3）mi R-335-5p可通过下调DKK-1,激活Wnt/β-catenin信号通路,进而诱导N-SBPC表型向OA-SBPC的转化。结论1.成功提取并鉴定了符合ISCT相关标准的SBPC。2.与N-SBPC相比,OA-SBPC的增殖能力和成骨能力较N-SBPC明显提高,但矿化能力下降,且存在Wnt/β-catenin信号通路激活的情况。3.通过细胞水平的体外实验和组织水平的体内实验验证了OA-AC-Exo是OAAC诱导N-SBPC表型向OA-SBPC改变及Wnt/β-catenin信号通路激活的关键信使。4.Wnt/β-catenin信号通路的激活是导致SBPC表型改变的重要原因。5.OA-AC-Exo中激活Wnt/β-catenin信号通路进而诱导SBPC表型改变的关键成分mi R?335?5p,可通过下调Wnt/β-catenin信号通路上游抑制因子DKK-1来激活Wnt/β-catenin信号通路,进而诱导N-SBPC表型向OA-SBPC变化。6.提出并论证了假说“OA-AC-Exo—Wnt/β-catenin信号通路激活—SPBC表型异变—软骨下骨特征性病理改变”。