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目的:阿尔茨海默病(AD)是最常见的以痴呆为主要症状的神经系统退行性病变。现已明确,β淀粉样蛋白(Aβ)是AD的致病物质,而Aβ寡聚体神经毒性最强,是AD的核心致病物质,也是AD防治最为重要的靶点。外周血液中的单核细胞能迁移入脑并分化成小胶质细胞样的细胞,被称为“骨髓源性小胶质细胞”。骨髓源性小胶质细胞能有效的阻止Aβ的沉积和促进Aβ斑块在脑内的清除。我们在前期工作中发现,散发性AD病人的外周血单核细胞过表达cystatin F蛋白,过表达cystatin F的单核细胞能够有效地降解Aβ寡聚体。本论文将探讨单核细胞过表达cystatin F对AD模型小鼠认知功能障碍的改善以及相关的分子机制。研究方法:1.构建单核细胞特异性过表达人cystatin F小鼠,检测cystatin F转基因小鼠体内human cystatin F的表达;2.检测cystatin F转基因小鼠,cystatin F转基因小鼠与淀粉样前体(APP)/早老素(PS1)转基因小鼠杂交所得小鼠,外周血以及脑内Aβ的表达;3.水迷宫实验,检测野生(WT)小鼠,cystatin F~+小鼠,APP~+/PS1~+小鼠,cystatin F~+/APP~+小鼠,四组转基因小鼠的学习与记忆能力;4.Cystatin F与Aβ体外结合实验即分别用Aβ1-40,Aβ1-42,以及Aβ42-1包被ELISA板,加入不同浓度的cystatin F重组蛋白,用anti-cystatin F抗体进行检测,读取OD450吸光光度值;5.将GST-cystatin F与人脑微血管内皮细胞在裂解液中共孵育,再利用GST pull down技术检测cystatin F与APP的互作;再利用商品化的GST-Aβ1-40,GST-Aβ1-42,以及构建并纯化所得的GST-C99融合蛋白,与U937细胞在裂解液中共孵育,利用GST pull down实验分析Aβ与cystatin F互作;6.在U937细胞的培养基中加入红色荧光标记的Aβ1-42或Aβ1-40,孵育24小时,再用带有绿色荧光的抗体标记cystatin F,应用激光共聚焦显微镜观察cystatin F和Aβ1-40或Aβ1-42的共定位。结果:1.构建得到cystatin F~+转基因小鼠,并检测其能特异性过表达人cystatin F;2.Cystatin F~+/APP~+双阳性转基因小鼠外周血与脑内的Aβ的含量明显比APP~+/PS1~+小鼠低;3.Cystatin F~+/APP~+双阳性转基因小鼠学习和认知功能障碍得到了改善;4.Cystatin F在体外结合Aβ1-40和Aβ1-42,并且呈现浓度依赖性;5.在GST-cystatin F与人脑微血管内皮细胞裂解液共孵育后,利用APP抗体检测到APP的表达;相反,在GST-Aβ1-42,GST-Aβ1-40以及GST-C99融合蛋白与U937细胞的裂解液共孵育后,能够检测到cystatin F的蛋白带。6.激光共聚焦显微镜观察到U937细胞中cystatin F与Aβ之间存在共定位。结论:Cystatin F参与APP/PS1转基因小鼠脑内以及外周血Aβ的清除,并能够改善APP/PS1转基因小鼠的学习与认知能力;Cystatin F能够直接与Aβ互作参与Aβ的代谢。