病毒性疾病给人类的生存和发展造成严重的威胁,有的病毒性疾病甚至曾经肆虐人类几个世纪之久,同时也给社会经济造成巨大的损失。而且,许多新出现的病毒仍持续在全球范围内对公共卫生造成严重的威胁。因此,为了有效地预防、控制以及消除病毒性疾病,深入地解析病毒侵染细胞的过程并揭示其侵染机制至关重要。然而,病毒在活细胞内的侵染过程是一个连续、复杂、动态的多步骤过程,实时、原位、精确地解析病毒与宿主细胞的相互作用机制,依然是病毒学问题研究中的重点和难点。多年来,本课题组为了克服传统生物学方法在病毒侵染机制研究方面的不足,结合具有优异光学性质的量子点建立了一种基于量子点的二维单病毒示踪技术,并成功地阐明了关于流感病毒的一些未见诸于报道的侵染机制。在以上研究背景和研究基础上,本论文以甲型流感病毒H9N2为模式病毒,发展基于量子点的多维单病毒示踪技术,并用于流感病毒侵染行为的研究,具体工作如下:(1)搭建一套三维单颗粒示踪平台,发展了基于量子点的三维单病毒示踪技术并研究了病毒依赖内体的转运机制。我们分别对量子点标记的病毒、含Rab5的内体及含Rab7的内体在活细胞内的转运过程进行三维全局化示踪,并细致地解析其运动行为。我们发现Rab5主要调控病毒从靠近细胞膜区域向细胞核周围转运的过程,而极少量的Rab7也参与这个过程,Rab7主要调控病毒在核周围区域的间歇性运动和受限运动。本部分工作揭示了流感病毒与内体相关的侵染机制。此外,也展示了基于量子点的三维单病毒示踪技术在研究病毒与细胞结构的动态相互作用方面的应用潜力,有助于深入探索细胞内的“货物”转运。(2)在基于量子点的单病毒示踪技术基础上进一步发展多通道实时成像技术,用于研究自噬参与的病毒早期侵染过程。首先,我们考察了病毒侵染对宿主细胞自噬的影响,发现病毒在侵染的早期阶段能够诱导自噬体的生成且会加快自噬体的运动。接着,利用基于量子点的单病毒示踪技术实时、原位地监测病毒与自噬体的相互作用行为,发现少部分的病毒(约20%)能够依赖自噬体从靠近细胞膜的区域被转运至细胞核周围。结合基于量子点的多维单病毒示踪技术,详细地研究了病毒与含Rab5蛋白的内体及自噬体相关的转运行为,发现病毒存在两种胞内转运途径:与Rab5蛋白相关的内吞途径;或者自噬途径。进一步的证据证实自噬体转运病毒的过程不依赖于Rab5蛋白(早期内体的标志物)。本部分工作首次揭示了自噬参与的病毒胞内转运机制,证实自噬也可以作为病毒胞内转运的一种途径,有助于深入地理解自噬与病毒入侵的相互关系。同时,也为自噬相关问题的研究提供了一种有力手段。(3)在(2)的基础上,我们利用基于量子点的多维单病毒示踪技术研究病毒依赖自噬体转运过程中与Rab7相关的侵染行为。首先,我们证实进入自噬途径的病毒能够释放病毒的核酸,且该过程与Rab7相关。接着,我们实时地监测了自噬体与Rab7相关的转运过程并对其运动行为进行分析,探讨自噬体与Rab7的相互作用。同时,利用基于量子点的多维单病毒示踪技术,初步探讨了 Rab7对病毒在依赖自噬体转运的过程的调控机制。结合(2)的工作,系统地解析了病毒依赖自噬途径的侵染行为,提示我们可将自噬途径作为抗病毒治疗的靶点,为发展更有效的抗病毒策略提供了新的视角。