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研究背景2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是临床上最常见的代谢疾病,主要是由慢性胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能进行性下降所引起。其中,胰岛β细胞的功能和数量是维持葡萄糖稳态的关键,而游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）可导致胰岛β细胞功能障碍。因此,如何有效地从脂毒环境下保护胰岛β细胞一直是研究的热点。近年来,越来越多的研究发现,在脂毒性胰岛β细胞功能障碍中存在细胞焦亡的身影。焦亡是一种Caspase依赖的程序性细胞死亡机制,该过程的特点是细胞膜破裂和通过GSDM（Gasdermin）蛋白家族介导的细胞内容物的释放。有研究表明,在T2DM小鼠模型中NLRP3炎症小体存在过度激活,敲低NLRP3后其胰岛素抵抗及代谢异常均有所改善。其中,NLRP3炎症小体的激活是细胞焦亡发生的重要环节之一。另一方面,IL-1 β等促炎因子可以通过肿瘤坏死因子依赖与非依赖的途径对胰岛素敏感性造成影响,而焦亡的特征之一便是促炎因子的大量释放。因此,焦亡可以作为T2DM的一个潜在的治疗靶点,靶向细胞焦亡的相关治疗有望延缓T2DM的病程。NR4A1属于NR4A（nuclear receptors 4A）亚家族,是一种天然配体未知的孤儿核受体,其亚家族成员主要通过在外源刺激下调节基因的表达来发挥调节细胞增殖等作用,包括神经生长因子（nerve growth factor,NGF）在内的许多刺激已经被证实在多种不同类型的细胞中诱导NR4A家族成员的转录,而其中就包括FFA,且在FFA诱导的胰岛β细胞功能障碍中,NR4A1是其重要的转录调节因子之一。近期,有文献表明NR4A1与HIPPO-YAP通路密切相关,NR4A1可以通过阻止YAP入核促使YAP降解增多,而据研究YAP可以通过与NLRP3结合致使NLRP3降解受到抑制,该过程可能与焦亡密切相关。此外,Hippo通路在T2DM的发生与发展中也起着重要作用,Hippo通路的长期活化可以使胰岛β细胞分化异常、进而导致胰岛β细胞功能障碍诱发T2DM。对于NR4A1是否可以通过对YAP进行调节进而影响细胞焦亡的发生发展、以及该过程是否参与T2DM脂毒环境所导致的胰岛β细胞焦亡,目前还没有明确的研究。研究目的探究2型糖尿病脂毒性对胰岛β细胞焦亡的影响及NR4A1是否可通过Hippo通路介入该过程。研究方法1)T2DM小鼠模型的建立。采用高脂喂养和STZ联合诱导T2DM小鼠模型并继续行高脂喂养,常规监测小鼠体重,IPGTT、IPITT实验检测小鼠糖代谢情况。2)检测T2DM小鼠胰岛β细胞焦亡的情况。分离小鼠的胰腺,通过扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）和透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察小鼠胰岛β细胞是否存在焦亡。3)检测PA是否可以诱导MIN6细胞的焦亡。用不同浓度的PA处理MIN6细胞筛选最佳浓度,随后最佳的浓度的PA处理MIN6细胞不同的时间筛选最佳处理时间,两者均以GSDMD和GSDME的表达水平为基准。随后以该浓度和时间处理MIN6细胞,通过Western blot检测GSDMD介导的焦亡通路指标（NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、Caspase1、cleaved-Caspase1）和 GSDME 介导的焦亡通路指标（GSMDE、GSDME-N、Caspase3、cleaved-Caspase3）。ELISA检测IL-1β的释放情况。使用CCK-8检测细胞活力。LDH释放实验和PI染色检测细胞膜的破损情况。运用TEM观察MIN6细胞是否存在细胞膜连续性中断。4)筛选T2DM患者与正常人差异表达基因。通过limma R package对GSE29221芯片（T2DM患者与正常人骨骼肌组织）的数据行差异表达分析,并对差异表达的基因进行GO分析和KEGG分析。5)检测NR4A1是否参与PA诱导的MIN6细胞焦亡发生发展的过程。对NR4A1全敲除的小鼠胰腺组织进行免疫组化染色,观察GSDMD和GSDME的变化情况。通过siRNA沉默NR4A1和质粒过表达NR4A1后用Western blot观察其对PA刺激下MIN6细胞焦亡通路的影响,包括GSDMD焦亡通路的Caspase1、cleaved-Caspase1、GSDMD、GSDMD-N、NLRP3 和 GSDME 焦亡通路的 Caspase3、cleaved-Caspase3、GSDME、GSDME-N。用IL-1 β释放和TEM对焦亡程度进行验证。用CCK8法检测细胞活力。6)探究NR4A1是否可以通过Hippo通路影响细胞焦亡进程。通过clusterProfiler R包对NR4A1进行GO和KEGG富集分析。Western blot检测随着PA刺激时间的增加NR4A1、YAP、p-YAP及焦亡指标GSDMD和GSDME的变化情况。随后过表达NR4A1观察 NLRP3/Caspase1/GSDMD 焦亡通路相关指标及 Hippo 通路 MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP的变化情况。研究结果1)T2DM小鼠模型的成功建立。与wt小鼠相比较,T2DM小鼠模型的体型以及体重均要大于wt小鼠。IPGTT实验证实小鼠胰岛β细胞功能受损及代谢紊乱,IPITT实验证实小鼠胰岛素抵抗。2)T2DM小鼠胰岛β细胞可能存在焦亡。SEM显示T2DM小鼠胰腺部分细胞表面出现凸起物,STM显示胰岛β细胞内出现空泡和细胞膜连续中断。3)PA可以诱导MIN6细胞发生焦亡。GSDMD和GSDME分别随着PA的浓度和时间的延长不断增加,选定0.4mM和36h作为后续刺激的浓度和时间。0.4mM PA处理MIN6 细胞 36h 后,GSDMD 介导的焦亡通路 NLRP3、cleaved-Caspasel、GSDMD、GSDMD-N的表达出现上调,GSDME介导的焦亡通路中GSDME、cleaved-Caspase3表达有所上调。较对照组,PA处理组的细胞活力有明显下降,IL-1 β表达有所增高,LDH释放增加,PI染色为阳性,TEM可观察到细胞内空泡、细胞膜形成孔道及细胞破裂。4)NR4A1在T2DM患者中表达上调。通过对GSE29221芯片（T2DM患者与正常人骨骼肌组织）差异表达分析,发现T2DM患者中表达上调基因72个和表达下调基因196个。在对差异基因进行GO分析,生物学过程（Biological Process,BP）分析结果显示差异表达基因主要富集在细胞结构、蛋白修饰和调控生长发育等方面。细胞定位（Cellular Component,CC）分析结果提示其主要集中在细胞外基质以及膜结构等部位。分子功能（Molecular Function,MF）分析结果显示其主要富集在在细胞外基质成分的组成和连接、受体活性的调节等方面。KEGG分析显示差异表达基因在ECM-受体互作、细胞因子-受体互作和趋化因子信号通路、PI3K-Akt等通路中富集明显。通过筛选,锁定NR4A亚家族,其中NR4A亚家族成员NR4A1在T2DM患者中表达上调且差异明显。5)NR4A1参与调节PA诱导的MIN6细胞焦亡进程。对NR4A1全敲小鼠的免疫组化结果显示,较对照组相比、GSDMD表达有些许升高。对MIN6细胞的NR4A1进行敲除并给予PA刺激,与对照组和PA处理组相比,其GSDMD焦亡通路的指标cleaved-Caspase1、GSDMD-N上调明显、NLRP3较PA处理组有轻度增加,GSDME焦亡通路仅cleaved-Caspase3增加明显,而过表达NR4A1并给予PA处理后除GSDME-N外、焦亡相关蛋白较PA处理组均有不同程度的降低。NR4A1沉默后给予PA的MIN6细胞的IL-1 β释放要高于PA组,过表达后IL-1 β的水平较PA组有所减轻。CCK8实验结果提示NR4A1敲除+PA处理组的细胞活力较PA处理组弱,而NR4A1过表达组的细胞活力要强于PA处理组。TEM可见NR4A1敲除+PA处理组的细胞已完全破裂,细胞内容物大量流出,而PA处理组仅有空泡的出现和细胞膜孔道的形成,NR4A1过表达+PA处理组可见细胞膜孔道形成但孔道的直径与PA处理组的相比较小。6)NR4A1可以通过Hippo-YAP影响脂毒条件下细胞焦亡的进程。NR4A1 GO富集分析结果显示,在BP上主要介导细胞外基质、细胞粘附、胰岛β细胞增殖等过程,在CC上主要定位于细胞外基质、膜结构等位置,在MF上主要执行连接和组成细胞外基质、结合细胞黏附分子和结合分泌蛋白等功能。KEGG结果显示NR4A1富集程度最高的通路主要是T2DM、PI3-Akt通路、钙信号通路等通路。Western blot实验结果提示随着PA刺激时间的增加GSDMD焦亡通路指标（GSDMD、GSDMD-N、NLRP3）表达逐渐上升,p-YAP表达逐渐下降,NR4A1表达先高后低,YAP稍有减低后升高。PA处理MIN6细胞后,除焦亡指标的增加外可见Hippo通路被激活（MST1、p-LATS和p-YAP下调,LATS和YAP上调）,而NR4A1过表达+PA刺激组可逆转除MST1、LATS1和p-LATS1外的上述表达情况。研究结论T2DM小鼠模型胰腺电镜结果提示胰岛存在焦亡现象。PA可以诱导MIN6细胞发生焦亡。NR4A1在T2DM患者中和正常人之间表达有差异且NR4A1的高表达可以促进YAP的磷酸化、最终抑制细胞焦亡的发生与发展。