研究背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病发病率高、预后差,对社会造成了极大的负担,疾病防治刻不容缓。年龄作为动脉粥样硬化性心血管疾病的主要危险因素,血管衰老对冠心病的发展及预后有重要影响,研究表明血管内皮细胞的衰老与冠心病的发生密切相关:衰老的内皮细胞一氧化氮生成减少、内皮素释放增加,导致血管舒张功能降低;此外衰老细胞可激活多种促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶,形成衰老相关分泌表型促进了冠心病的发展,对血管内皮细胞衰老的研究有助于了解具体的发病机制。细胞衰老是细胞增殖、分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程,涉及代谢变化和细胞内稳态的破坏,最终可能导致器官衰竭和死亡。衰老受遗传和环境因素共同影响,在冠心病发病进展中,各种危险因素如饮食、吸烟、压力、高血压和昼夜节律等,可通过表观遗传标记的改变影响血管内皮细胞衰老最终导致疾病发生。表观遗传学作为当代生命科学最为热点的领域,指在不影响基本核苷酸编码的情况下染色质的复制后改变,作用方式包括DNA修饰、组蛋白修饰、染色质重塑及RNA修饰等。当前临床对冠心病的防治主要靠药物进行调脂、降压等保守治疗,但发病率仍在增加,防治拐点尚未到来。在传统防治研究进入瓶颈之际,从表观遗传领域入手探究对血管衰老的调控进而预防冠心病的发生,具有重要的研究意义。RNA修饰近年来国内外研究火热,多项研究证明其可参与调控机体多项生命活动。甲基化修饰是RNA最主要的修饰类别,已有数十篇文献报道RNA甲基化修饰与心血管疾病密切相关,但RNA修饰与冠心病的关系目前国内外研究报道相对匮乏。最新研究发现m6A甲基化酶（MELLT3/MELLT14和WTAP）可通过调控m RNA影响衰老相关蛋白P21和P27的表达,进而影响细胞的衰老。2018年底,一种全新的N6,2’-O-二甲基腺嘌呤（m6Am）修饰酶PCIF1被发现并鉴定,不同于m6A的多位点修饰,m6Am修饰主要位于5’m7Gppp帽子结构后的第一个碱基,当前实验已经证明PCIF1在不同物种中具有很高的保守性,且PCIF1对m RNA稳定性及翻译有影响,提示PCIF1在生命活动起到重要的调控作用。我们猜想PCIF1可能参与血管内皮细胞的衰老的调控,在本研究中我们首先比较了不同衰老状态下,动物血管组织、血管内皮细胞内PCIF1的表达改变。在此基础上在细胞水平干预PCIF1的表达,通过检测可反应衰老的相关标记物来验证PCIF1对内皮细胞衰老的调控,并对相关调控机制做初步探讨。研究目的:1.明确PCIF1在血管内皮细胞衰老中的作用。2.明确PCIF1是否调控Sirt3而影响内皮细胞衰老。研究方法:1.明确PCIF1在血管衰老中的作用（1）正常饮食饲养C57BL/6J小鼠,取16月龄小鼠作为衰老组,3月龄老鼠作为年轻对照组,剥离主动脉组织提取RNA,通过qRT-PCR实验比较组织内PCIF1表达改变。（2）提取原代脐静脉内皮细胞,通过反复传代培养的方式构建细胞衰老模型,以第二代（P2）作为年轻对照组,第七代（P7）作为衰老组。分别提取RNA和蛋白,q RT-PCR实验、免疫印迹实验（Western blot）和免疫荧光实验分别定量检测细胞衰老状态下PCIF1含量改变。（3）采用si RNA和质粒对PCIF1在脐静脉内皮细胞分别进行特异性沉默和过表达后,检测内皮细胞衰老数目（β-gal染色）、衰老相关表型（划痕实验、体外成管实验）、衰老相关标记基因（P16、P21、P53、IL-6）改变（q RT-PCR、Western Blot）,明确PCIF1对内皮细胞衰老的调控作用。2.明确PCIF1是否调控Sirt3的表达进而影响内皮细胞衰老（1）血管内皮细胞内特异性沉默PCIF1表达后收集细胞进行转录组测序,了解PCIF1对内皮细胞功能和分子通路的调控,宏观了解PCIF1的分子功能,根据实验目的筛选PCIF1调控细胞衰老的下游靶基因,q RT-PCR和Western blot实验进行验证后确定Sirt3作为调控的关键靶分子。（2）放线菌素D抑制RNA转录后,不同时间点分别收集对照组和PCIF1特异沉默组的细胞,q RT-PCR法检测不同时间细胞内Sirt3表达量用以计算相对降解速率,了解PCIF1对Sirt3 m RNA的稳定性的影响。（3）在细胞内特异性沉默PCIF1表达的同时过表达Sirt3,分别检测内皮细胞衰老数目（β-gal染色）和衰老相关标记基因（P16、P21、P53、IL-6）改变（Western Blot）,观察PCIF1对细胞衰老的影响能否通过Sirt3补救。研究结果:1.3月龄小鼠对比16月龄小鼠,衰老血管组织中PCIF1含量显著降低,在动物层面证实了PCIF1与血管衰老相关。2.P2代内皮细胞对比P7代细胞,衰老内皮细胞中PCIF1表达显著下降,细胞层面证实了PCIF1与血管内皮细胞的衰老相关。3.在脐静脉内皮细胞中沉默PCIF1表达后,衰老细胞数目增多,细胞运动能力下降,衰老相关基因表达增多,细胞出现加速衰老;反之在细胞中过表达PCIF1可延缓细胞衰老。4.测序结果显示:细胞内沉默PCIF1表达后,5361个基因表达发生改变,基因下调数为2920,其中1643个基因表达差异超过1.2倍。通过对下调的基因进行功能和分子通路分析,提示在细胞衰老通路可见大量基因富集。5.根据测序结果初步筛选出5个PCIF1可能调控内皮细胞衰老的候选基因,q RT-PCR检测沉默PCIF1表达后候选基因的下降幅度,同时结合科学文献对基因功能的研究,最后选定Sirt3作为靶分子。Western blot实验检测到在PCIF1沉默和过表达的情况下,Sirt3基因表达出现对应改变,进一步证实了实验结果。6.转录抑制剂处理细胞后,PCIF1沉默组中Sirt3 m RNA降解速率快于对照组,PCIF1可维持Sirt3 m RNA的稳定性。7.内皮细胞中沉默PCIF1表达可加速细胞衰老,在Sirt3过表达的情况下衰老的细胞数目相对减少,衰老相关基因的表达相对降低,过表达Sirt3可对因PCIF1介导的细胞衰老起到“补救”效果。研究结论:1.甲基化转移酶PCIF1参与血管内皮细胞的衰老调控,对细胞衰老起到保护作用;2.PCIF1可能通过调控Sirt3信号通路而参与影响内皮细胞衰老。研究背景:高血压是心血管病的危险因素,了解高血压的发病原因是防治的关键。近年来有证据表明母代子宫内环境和生命早期相关事件的影响可致子代高血压发生,其中包括妊娠期高血糖会给胎儿的生长发育造成一定影响,导致正常的心血管或肾脏的结构和功能损害,延续至成年高血压发病。研究表明内质网应激在子代高血压的发病中发挥了重要作用,内质网被是细胞压力的主要传感器,在蛋白合成、折叠和运输中起着重要作用,内质网功能的破坏会导致未折叠蛋白反应的激活,最终破坏细胞功能并导致高血压发生。本实验推测内质网应激可能在因母代糖尿病导致的子代高血压的发病中发挥了重要作用,为验证实验设想,首先建立了母代孕期糖尿病大鼠模型,检测到子代大鼠成年后血压显著高于对照组且在子代用内质网应激抑制剂干预后子代大鼠血压可恢复正常,在此基础上探究了内质网应激在子代高血压发病中的作用机制。研究方法:腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病孕期母代大鼠模型,子代大鼠成年后血压出现升高,在子代大鼠中腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠盐（4-PBA）或牛磺熊去氧胆酸（Tudca）后,血压升高的大鼠血压可恢复正常,处死子代大鼠后分别提取肠系膜血管内皮细胞进行原代培养,检测:1.原代培养的内皮细胞培养基中TNF-α水平改变;2.原代培养的内皮细胞内质网应激通路蛋白的改变;3.原代培养的内皮细胞e NOS表达改变。研究结果:1.母代糖尿病组的子代（DMO）较母代对照组的子代（CMO）,其肠系膜血管内皮细胞培养基中TNF-α水平明显增高。2.母代糖尿病组的子代（DMO）较母代对照组的子代（CMO）,肠系膜血管内皮细胞中ATF-6,p-IRE的蛋白表达均升高,在内质网应激抑制剂干预后,可降至正常范围。3.母代糖尿病组的子代（DMO）较母代对照组的子代（CMO）,肠系膜血管内皮细胞在总e NOS表达上无明显差异,但p-e NOS表达降低,内质网应激抑制剂干预后可恢复正常。研究结论:1.母代孕期糖尿病可致子代高血压大鼠肠系膜血管内皮细胞中内质网应激水平增高。2.母代孕期糖尿病可致子代高血压大鼠肠系膜血管内皮细胞中磷酸化eNOS表达异常。