淋巴循环是机体循环系统的重要组成部分,淋巴管舒缩功能是淋巴循环的动力学基础。在体与离体实验均已表明,在休克的发展进程中,淋巴管收缩性出现双相变化,即早期升高,晚期降低；同时,淋巴管对血管活性物质去甲肾上腺素(NE)或P物质(SP)的收缩性亦出现了类似的双相变化,提示淋巴管低反应性是淋巴管低收缩性的重要机制。由于重症休克时的淋巴循环功能障碍是促进不可逆休克发展的重要因素,因此,淋巴管低收缩性及其发病机制在休克发病学中的作用值得深入研究。研究表明,小G蛋白RhoA、Rac1对于失血性休克血管反应性的双相变化具有重要的调节作用,且RhoA与Rac1活性的平衡同样调节了失血性休克后血管反应性的双相变化；同样,Rho也调节了正常状态下离体淋巴管的泵活性。那么,RhoA和Rac1在休克淋巴管中的表达状态如何?是否具有调节休克离体淋巴管收缩性的作用?其作用机制与哪些因素有关?RhoA和Rac1两者间的相互作用是否同样会影响休克淋巴管的收缩性?这些研究对于进一步开展休克淋巴管收缩功能的生物学调控、进而改善休克的淋巴微循环障碍具有一定的理论与应用价值。为此,本研究在观察RhoA与Rac1在休克不同时间淋巴管组织表达的基础上,进一步采用微血管压力-直径测定技术,应用RhoA-Rho激酶-MLCP与Rac1-PAK-MLCK信号通路工具药,观察RhoA与Rac1对失血性休克大鼠离体淋巴管收缩性的影响,进一步观察离体淋巴管对SP反应性的变化,为休克淋巴管收缩性的调控提供实验依据。应用126只Wistar雄性大鼠随机均分为对照组(control组,仅麻醉与手术)、休克组(shock组,按我室常规方法复制失血性休克模型,分*国家自然科学基金资助项目(30770845)、河北省自然科学基金资助项目(C2008000503)、河北省教育厅科学研究重点项目(ZH2007101)。为shock0h, shock0.5h、shock1h、shock2h、shock3h组),留取胸导管组织(n=21),其中每组9根淋巴管组织用于检测RhoA蛋白表达(western blotting方法),每组12根淋巴管组织用于检测RhoA、Racl、 PAK、MLCK磷酸化蛋白(p-RhoA、p-Rac1、p-PAK、p-MLCK)含量(ELISA方法)。结果发现,淋巴管组织RhoA蛋白表达呈双相变化,即shock0h、shock0.5h表达呈升高趋势,shock2h、shock3h淋巴管组织RhoA蛋白表达显著降低；淋巴管组织p-RhoA、p-MLCK水平在shock Oh、shock0.5h显著升高,在shock1h、shock2h、shock3h显著降低；同时,淋巴管组织p-Rac1、p-PAK在shock0.5h显著降低,后逐渐增加。在此基础上,本研究进一步观察了RhoA-Rho激酶-MLCP与Rac1-PAK-MLCK信号通路在休克离体淋巴管收缩性与反应性双相变化中的调节作用。首先,应用Wistar雄性大鼠54只,随机均分为control组(n=6)、shock0.5h组(n=18)、shock2h组(n=30),制备离体淋巴管条置于微管灌注系统,维持淋巴管跨壁压为3cmH2O,待淋巴管出现稳定的自发性收缩后,shock0.5h淋巴管分别与RhoA拮抗剂C3(60μg-L-1)、Rho激酶抑制剂Y-27632(6×10-6mol·L-1)孵育(作为shock0.5h+C3、shock0.5h+Y-27632组,n=6),shock2h淋巴管分别与Rho激动剂U-46619(5×10-7mol·L-1)、Y-27632+U-46619.MLCP抑制剂OA(1×10-6mol·L-1)、 OA+U-46619孵育(作为shock2h+U-46619、shock2h+Y-27632+U-46619、shock2h+OA、shock2h+OA+U-46619组,n=6),观察并记录淋巴管的收缩频率(CF)、收缩末期口径(ESD)、舒张末期口径(EDD)、被动管径(PD),计算紧张指数[TI=(PD-EDD)/PD×100%]、收缩幅度[CA=(EDD-ESD)/PD×100%]、泵流分数[FPF=(EDD2-ESD2)/EDD2×CF],结合CF作为评价淋巴管收缩性的指标；以control、shock0.5h、shock2h组淋巴管(均n=6)在不加任何药物、直接观察淋巴管的收缩性指标作为对照,评价RhoA对休克淋巴管收缩性的调节作用。结果发现,Y-27632可显著降低shock0.5h淋巴管CF、TI、FPF,且CF、 FPF显著低于control组。U-46619可提升shock2h淋巴管的CF、TI、FPF,恢复至对照组水平；Y-27632可抑制U-46619的作用,显著降低U-46619提升shock2h淋巴管CF、TI、FPF的作用；OA可降低shock2h淋巴管CF、TI、FPF,但与shock2h组无统计学差异,OA可抑制U-46619的作用。除C3可显著提高shock0.5淋巴管CA外,其它工具药均未对淋巴管CA发挥明显作用。研究结果提示,RhoA在休克淋巴管收缩性双相变化中具有显著的调节作用,其作用机制可能与RhoA激酶有关,MLCP的作用有待进一步验证。记录各组淋巴管或与相应工具药孵育后的基础数值之后,在浴槽中依次从低到高浓度加入SP母液,使终浓度为1×10-8mol·L-1、3×10-8mol·L-1、1×10-7mol·L-1、3×10-7mol·L-1,在每次加入SP的1min内,分别记录CF、EDD、ESD、PD,计算CA、TI、FPF。以加入不同浓度SP前后的CF、EDD、ESD、PD的最大差值△CF、△TI、△CA、△FPF,评价RhoA对休克淋巴管反应性的调节作用。结果发现,C3与Y-27632均可显著降低shock0.5h淋巴管对多个SP浓度点的△CF：在某些SP浓度点上,也可显著降低淋巴管△TI、△FPF; U-46619可显著提高shock2h淋巴管对多个SP浓度点的△CF、△TI与△FPF,降低shock2h淋巴管对多个SP浓度点的△CA;OA可显著提高shock2h淋巴管对多个SP浓度点的△C、F△FPF,降低△CA、△TI,与对照组和shock2h组均有统计学差异。研究结果提示,RhoA参与了休克淋巴管反应性的双相调节,该作用可能通过Rho激酶、MLCP实现。其次,应用36只Wistar雄性大鼠随机分为shock0.5h(n=18)、 shock2h(n=18)。按前述方法,各组在相应时间点分离胸导管制备离体淋巴管条,shock0.5h淋巴管分别与Rac1激动剂PDGF(20μgL-1)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7(1×10-5mol·L-1) PDGF+MLCK激动剂SP (1×10-7mol·L-1)孵育(作为shock0.5h+PDGF、shock0.5h+ML-7、shock0.5h+PDGF+SP组,均n=6);shock2h淋巴管分别与Rac1抑制剂NSC23766(5×10-6mol·L-1)、PAK抑制剂PAK-18(1×10-5mol·L-1)、SP孵育(作为shock2h+NSC23766、shock2h+PAK-18、shock2h+SP组,均n=6),观察并记录淋巴管的CF、EDD、ESD、PD。研究发现,PDGF可显著降低shock0.5h淋巴管的CF、TI、FPF,并且TI与对照组有统计学差异；ML-7也可降低shock0.5h淋巴管的CF、TI、FPF,显著低于shock0.5h组和对照组水平,淋巴管CA无显著变化；SP可抑制PDGF的作用,对shock0.5h淋巴管的CF、TI、FPF有显著提升作用,高于对照组水平。NSC23766、PAK-18与SP均可提升shock2h淋巴管的CF、TI、FPF,显著高于shock2h组和对照组水平；此外,PAK-18可提高shock2h淋巴管CA,高于对照组；SP可降低淋巴管CA,显著低于shock2h组和对照组水平。结果提示,Rac1具有调节休克淋巴管收缩性双相变化的作用,该作用可能是通过PAK、MLCK实现的。记录shock0.5h、shock2h淋巴管与相应工具药孵育后的基础数值后,进一步给予梯度浓度SP,按上述方法分别记录加入不同浓度SP后淋巴管CF、EDD、ESD、PD,计算TI、CA、FPF,结合前一部分实验中control、shock0.5h.shock2h淋巴管的△CF、△TI、△CA,△FPF作为对照,评价Rac1对休克淋巴管反应性的作用。结果发现,PDGF可显著降低shock0.5h淋巴管对多个SP浓度点的△CF、△TI、AFPF；在某些SP浓度点上,ML-7降低了shock0.5h淋巴管的△CF、△CA、△TI、△FPF;NSC23766与PAK-18均可提高shock2h淋巴管对多个SP浓度点的△CF与△FPF,降低△CA、△TI,低于对照组和shock2h组水平。研究结果提示,Rac1参与了休克淋巴管反应性的双相调节,其机制与PAK、MLCK有关。最后,为了观察RhoA与Rac1相互作用对失血性休克大鼠离体淋巴管收缩性与反应性的影响,应用24只Wistar雄性大鼠复制shock2h模型,在相应时间点分离胸导管制备离体淋巴管条,分别与PDGF+U-46619.ML-7+U-46619、C3+NSC23766、NSC23766+Y-27632孵育(作为shock2h+PDGF+U-46619、shock2h+ML-7+U-46619、 shock2h+C3+NSC23766、shock2h+Y-27632+NSC23766),观察并记录CF、EDD、ESD、PD。研究发现,PDGF与ML-7均可显著降低U-46619提升shock2h淋巴管收缩性的作用,淋巴管CF、TI、FPF显著低于shock2h+U-46619组；C3与Y-27632均可显著降低NSC23766的作用,降低淋巴管CF、TI、FPF,显著低于shock2h+NSC23766组,并且shock2h+Y-27632+NSC23766组淋巴管CF、TI、FPF显著低于对照组和shock2h组。记录shock2h淋巴管与相应工具药孵育后的基础数值之后,进一步将给予梯度浓度SP后,观察淋巴管反应性的变化。结果发现,ML-7与PDGF可抑制U-46619对shock2h淋巴管△CF、△FPF的作用,shock2h+PDGF+U-46619、shock2h+ML-7+U-46619与shock2h+U-46619相比,在多个SP浓度点△CF、△FPF显著降低；C3与Y-27632可抑制NSC23766提升shock2h淋巴管收缩性,△CF与△FPF显著低于、△CA与△TI显著高于shock2h+NSC23766组。结果提示,在RhoA与Rac1调节休克淋巴管收缩性与反应性双相变化的作用中,RhoA与Racl两者的作用是相互拮抗的。综上,RhoA与Rac1参与了休克淋巴管收缩性与反应性的双相调节；RhoA作用与Rho激酶-MLCP有关,Rac1的作用通过PAK.MLCK实现；且RhoA与Rac1的作用相互拮抗；以RhoA和Rac1作为药物靶点,可进一步调控休克淋巴管的收缩性,研究结果为干预重症休克淋巴微循环障碍提供了有利的实验依据。