目的:构建hTSHR原核表达质粒,在大肠杆菌系统中表达来获得结构完整并具有一定免疫活性的hTSHR蛋白。方法:设计引物,利用PCR方法钓取目的基因,酶切pET-28a(+)质粒载体将其线性化,通过同源重组的方法定向连接目的基因和线性化载体,将连接成功的重组DNA分子转化细菌感受态细胞。阳性克隆进行菌落PCR鉴定,将PCR阳性的菌液进行测序与比对分析,与目的基因序列完全重合的的即为构建成功的hTSHR原核表达质粒。重组后的质粒pET-28a(+)-hTSHR转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导重组蛋白表达,以TSHR抗体、His抗体以及Graves患者TRAb阳性血清为探针,用Western blotting鉴定融合蛋白表达情况及其免疫活性。10%SDS-PAGE电泳并考马斯亮蓝染色探讨表达条件及表达形式。结果:PCR扩增得到2366 bp的hTSHR cDNA片段,与预期长度相符。重组质粒于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后,用TSHR及His特异性抗体做探针,Western blotting证实融合蛋白在100 KD处有显著增强的特异性蛋白条带。表达的融合蛋白可与TRAb阳性患者血清特异性结合,证实有一定的免疫活性。IPTG最佳诱导浓度是0.5 mmol/L,诱导时间是3 h。大肠杆菌中表达的hTSHR蛋白以可溶性的状态存在。结论:本实验构建了pET-28a(+)-hTSHR原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达了hTSHR蛋白,该蛋白可与TRAb特异性结合。