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蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）是脑卒中的一种亚型,具有高死亡率、高致残率的特点,主要由颅内动脉瘤破裂引起。目前临床上虽有弹簧圈和动脉瘤夹闭手术治疗方式,但因出血后继发的早期脑损伤（early brain injury,EBI）和迟发性脑损伤,67%的SAH患者手术后依然有不同程度的神经损伤。研究表明神经元凋亡在SAH后EBI中发挥着关键作用。因此,针对神经元调亡信号的保护性策略可能改善SAH预后。热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）是小热休克蛋白家族（small heat shock proteins,HSPBs）成员之一,可作为分子伴侣降低蛋白聚集程度,协助蛋白酶的降解作用,也可抑制细胞凋亡。HSP27在脑缺血等多种神经系统疾病模型中发挥神经保护作用,主要机制源于其抗细胞凋亡活性。研究表明,在SAH模型的脑干和脑血管中存在HSP27及其磷酸化形式的表达变化,提示HSP27与SAH脑损伤有关。但是HSP27是否与SAH患者的临床病理相关?是否在SAH模型中也发挥神经保护作用?是否通过调控细胞凋亡而保护EBI?HSP27的靶向调控是否是改善SAH预后的潜在保护策略?这些问题尚待解答,亟需系统研究。本研究首先检测临床SAH患者脑脊液中HSP27表达变化,分析了其与疾病严重程度（分级）的相关性;SAH模型上,研究了 HSP27在脑脊液和基底皮层区的表达变化,探究了敲低内源性HSP27表达或外源性基因过表达HSP27对SAH脑损伤的影响;筛选了源于HSP27 N末端的抗原代神经元凋亡的有效肽段,进而验证了有效短肽对SAH脑损伤的保护作用。研究内容包括:1.aSAH患者脑脊液中HSP27表达变化研究经山东省立医院伦理委员会批准及患者同意,纳入73例动脉瘤SAH患者（aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH）和 20 例常压脑积水患者（normal pressure hydrocephalus,NPH）,通过腰椎穿刺或脑外室引流采集患者脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）,应用ELISA方法检测CSF中的HSP27水平。统计分析发现,相比NPH患者,aSAH患者患病第1天CSF中的HSP27水平显著升高;从时间曲线上,HSP27水平在aSAH后第1天最高,第2-4天逐渐降低,第5-7天又有增加的趋势。并且,aSAH后第1天CSF中HSP27浓度在疾病临床分级（Hunt-Hess分级,WFNS分级,改良Fisher评分）轻重程度间具有统计学差异。提示HSP27在aSAH早期EBI中发挥作用,所以,本研究的后续实验均探讨HSP27在SAH后72h内的作用。2.SAH模型大鼠CSF和基底皮层神经元中HSP27表达变化研究为了进一步探讨HSP27在SAH后72h内的具体作用,本研究应用枕大池单次注射自体血的方法构建了 SAH大鼠模型,将大鼠随机分为5组,sham组（假手术组）、SAH后6h、SAH后12h、SAH后24h、SAH后72h组,在相应时间点,枕大池采集大鼠CSF,通过ELISA方法检测了 HSP27在SAH后大鼠CSF中的表达变化,同时通过灌注后取鼠脑制作冠状切片,用免疫荧光的方法检测了 SAH后大鼠基底皮层神经元中的HSP27表达变化。结果显示,CSF中,相比sham组,SAH后12 h HSP27浓度显著升高;相比SAH后12h组,24 h时HSP27浓度显著下降。基底皮层神经元中,相比sham组,SAH 12 h的HSP27+NeuN+细胞数量显著升高;相比SAH后12 h组,SAH后72 h的HSP27+NeuN+细胞数量显著下降;而HSP27+Iba1+细胞数量在三组之间无显著差异,提示HSP27在SAH早期发挥作用的主要场所可能在神经元内。HSP27的表达在aSAH患者和SAH模型大鼠患病早期均有显著升高的过程,提示HSP27在SAH早期发挥重要作用。3.动物模型检测敲低内源性HSP27表达对SAH脑损伤的影响为了进一步探究内源性HSP27的具体作用,本研究构建了 pAKD-CMV-EGFP-H1-shRNA-HSP27载体,设计了动物实验,将大鼠随机分为sham组、SAH+Vehicle组（注射生理盐水）、SAH+NC 组（注射 pAKD-CMV-EGFP-H1-shRNA-NC 病毒）、SAH+shRNA 组（注射 pAKD-CMV-EGFP-H1-shRNA-HSP27 病毒）,SAH 建模前 1 9 天将包装病毒注射入大鼠侧脑室,SAH后48h时行神经行为学评分、IF（冠状切片）、Western blot（直接取脑,切取基底皮层组织）、TUNEL检测。结果显示,shRNA-HSP27病毒可高效率转染入大鼠基底皮层神经元,并成功敲低了 HSP27的内源性表达,进而恶化了 SAH后大鼠神经功能缺损、增强了基底皮层区细胞凋亡。4.动物模型检测过表达HSP27对SAH脑损伤的影响为了验证HSP27在SAH早期的保护作用,本研究构建了 pAAV-CAG-HSP27-3FLAG载体,检测了外源性过表达HSP27对大鼠SAH后早期的影响。首先,将包装病毒注射入正常大鼠的侧脑室,ELISA检测大鼠脑脊液中的IL-1β和IL-6两种炎症因子,结果显示,相比对照组,注射病毒组的两种炎症因子水平均无显著变化,其不会引起大鼠神经炎症反应。然后,设计动物实验,将大鼠随机分为sham组、SAH+vehicle（注射生理盐水）、SAH+Con（注射 pAAV-CAG-3FLAG 病毒）、SAH+HSP27（注射pAAV-CAG-HSP27-3FLAG病毒）组,SAH建模前19天将包装病毒注射入大鼠侧脑室,SAH后48h时,行神经行为学评分、IF、Western blot、TUNEL检测。结果显示,AAV-HSP27-3FLAG可高效率转染入大鼠基底皮层细胞,并在细胞中成功表达,外源性过表达HSP27改善了 SAH后大鼠神经功能缺损、显著减少了基底皮层区凋亡细胞数量,降低了 p-MKK4,p-JNK,p-c-Jun以及active caspase-3表达量。5.筛选抗原代神经元凋亡的HSP27N端有效肽段根据文献报导,HSP27 N端（1-120个氨基酸）可保护体外神经元免受缺糖缺氧诱导的死亡。为了找到更精确的效应区,本研究将N端1-120氨基酸分成5个肽段HSP271-30、HSP2731-60、HSP2761-90、HSP2765-90、HSP2791-120,在原代神经元凋亡模型上筛选有效肽段。胎鼠大脑皮质分离原代神经元,培养到第12天,CCK8检测确认了五种肽段对原代神经元无显著毒性。1:50的溶血产物诱导培养至12天的原代神经元凋亡,然后TUNEL和Western blot检测五种肽段的抗凋亡活性。结果显示,相比HSP271-30、HSP2731-60、HSP2791-120 组,HSP2761-90、HSP2765-90 肽段组的凋亡细胞数量显著降低,细胞总蛋白中的active caspase-3含量显著减少,说明HSP2765-90肽段是抑制原代神经元凋亡的有效肽段。6.动物模型评估TAT-HSP2765-90对SAH脑损伤的治疗效果筛选到有效肽段HSP2765-90后,本研究又设计了融合肽TAT-HSP2765-90及其动物体内验证实验,将大鼠随机分为sham组、SAH+vehicle（注射生理盐水）、SAH+TAT（注射TAT）、SAH+TAT-HSP27（注射TAT-HSP2765-90）组,侧脑室注射时间为SAH后30min,48h时行神经行为学评分、TUNEL和Western blot检测。结果显示,TAT-HSP2765-90可降低active caspase-3活性,减少基底皮层区凋亡细胞数量,整体上改善SAH后大鼠的神经功能缺损。同时,合成了TAT-HSP2765-90-FITC,SAH后30min时注射入大鼠侧脑室,SAH后48h时检测到了 FITC信号与NeuN明显共定位。综上,本研究发现aSAH患者第1天CSF中HSP27水平显著升高且浓度与疾病严重程度相关;大鼠SAH后12h时CSF及基底皮层神经元中HSP27水平均显著升高,敲低内源性HSP27表达恶化了 SAH大鼠的脑损伤,然而HSP27过表达可改善SAH大鼠的脑损伤,其机制与抑制p-MKK4、p-JNK、p-c-Jun、active caspase-3活性进而抑制细胞凋亡有关。HSP2765-90肽段有效减少了原代神经元凋亡。TAT-HSP2765-90改善了SAH后大鼠的神经功能缺损,并减少了基底皮质区的细胞凋亡。以上发现提示HSP27在SAH脑损伤中发挥保护作用,为进一步研究HSP27作用机制奠定了实验基础,筛选到的模拟短肽具有潜在的临床转化价值。