浒苔DMSP裂解酶L(dddL)基因的克隆与表达分析

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二甲基硫(DMS)是海洋中主要的挥发性硫化物,对全球气候变化及硫循环有重要影响。二甲基巯基丙酸(DMSP)是 DMS的重要前体,在 DMSP裂解酶的作用下分解为 DMS和丙烯酸。DMSP是海洋植物产生的渗透调节物质,大量存在于海藻和盐生高等植物体内。含有DMSP的生物体死亡之后,DMSP被海洋细菌的二甲硫醚生成酶降解,生成二甲硫醚(DMS)和丙烯酸。DMS从海洋水面逸出,进入大气形成酸雨;由于 DMS能形成云,所以有降低温室效应的作用。DMSP本身则对哺乳动物、禽类及水产动物(鱼和虾)的营养代谢有促进作用。酶学研究表明,动物肝脏中的两种硫甲基转移酶能把 DMSP分子中硫原子上的甲基转移出来,提供给机体代谢所需。作为海洋植物渗透调节物质的主要成分,DMSP来源于植物体内的蛋氨酸。DMSP裂解酶存在于不同的细菌中,也存在于一些藻类体内。  克隆分离了浒苔的 DMSP裂解酶 dddL基因。首先应用 PCR技术方法扩增dddL的部分 DNA序列。结果表明,获得的部分 DNA序列和 NCBI登录海洋细菌的 dddL的序列相似度非常高,可以初步确定为该酶在浒苔中 DNA序列。其次应用染色体步移的方法分别对 dddL部分基因序列的5′上游序列和3′下游序列进行扩增。最后利用5′RACE技术,获得一个克隆序列。在此基础上对这3个片段序列进行拼接,获得浒苔 dddL基因的全长序列与5′端启动子序列。阅读框编码223个氨基酸残基。推导蛋白的相对分子质量为24.74 kDa,等电点为8.45。dddL氨基酸序列的同源性分析显示,细菌和浒苔的dddL氨基酸序列都具有较高的同源性。跨膜结构预测结果表明,dddL编码的蛋白含有一段跨膜区。这些结果对进一步研究 dddL基因的结构与功能以及从基因调控角度探索 DMSP的裂解过程有重要意义。  DMSP具有多重作用,除了作为藻类中的渗透调节剂、抗冻剂、抗氧化剂等,还可以用来作为诱食剂,不仅能促进海水和淡水鱼虾的生长还能提高它们的应激能力以及改善肉质等。绿藻中的 DMSP含量很高,因而可用作 DMSP生产的原料。浒苔是一种常见的大型绿藻,利用荧光定量 RT-PCR技术对不同胁迫条件处理的浒苔 dddLmRNA的表达水平进行定量分析。不同盐度(10‰-60‰)处理组中,10‰盐度处理组的浒苔 dddL mRNA表达量最高。30‰、40‰、50‰和60‰盐度处理组之间 dddL mRNA表达量较低且无显著差异。  为进一步研究浒苔 dddL的生物学功能,将浒苔 dddL基因的开放阅读框区域克隆到表达载体 pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS。将阳性重组子培养于含有 AMP(100 U/mL)的 LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养后发现 dddL表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导浒苔 dddL蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。
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