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第一部分周期性机械应力条件下大鼠软骨细胞差异表达蛋白的筛选目的应用质谱技术筛选周期性机械应力条件下大鼠软骨细胞中差异表达蛋白质,并根据生物信息学分析结果确定目的蛋白。方法体外分离大鼠四肢的关节软骨,细胞常规培养传代。将2带软骨细胞分别分为正常培养组和加压培养组。加压组使用大小为0-200KPa,频率为0.1Hz的周期性压力每天刺激8h,连续3d。对照组正常条件下培养。采用实时定量荧光PCR法检测两组细胞aggrecan、collagen Ⅱ基因表达的水平;用直接计数和CCK-8法检测细胞增殖。提取各组细胞的总蛋白,依次进行同位素标记、液相色谱分离、Q-Exactive质谱仪鉴定和生物信息学分析。结果质谱共检测到5468个蛋白质,周期性应力下表达量发生改变的蛋白为485个,其中上调168个,下调317个。经生物信息学分析,共有478个蛋白被6079条GO(geneontology,基因本体论)功能条目注释,230个蛋白参与了 241条KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)信号通路。在差异表达的蛋白中Grb2表达增加1.49倍,生物信息学分析显示Grb2参与MAPK通路传导、与细胞增殖功能密切相关,确定该蛋白为进一步研究对象。结论本实验成功利用质谱技术筛选出了周期性机械应力条件下大鼠软骨细胞中差异表达蛋白质,为周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖及细胞外基质合成的机制研究奠定了基础。第二部分生长因子受体结合蛋白2(Grb2)在应力传导过程中的作用目的验证 Grb2(growth factor receptor-bound protein 2,生长因子受体结合蛋白 2)是否参与软骨细胞中机械应力信号传导,并初步探索该蛋白发挥作用的机制。方法1.运用慢病毒转染技术分别上调和下调大鼠软骨细胞中Grb2的表达。病毒转染72 h后,用荧光显微镜观察转染情况,实时荧光定量PCR、Western blot法检测两组细胞中Grb2的表达量。2.将Grb2上调组与下调组和各自空白载体对照组分别置于周期性机械应力与静态条件下培养,采用实时定量荧光PCR法检测aggrecan、collagenⅡ基因表达的水平;用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖;免疫荧光及免疫组化检测aggrecan、collagenⅡ 蛋白表达水平;Western blot 法检测 FAK-Tyr397、FAK-Tyr576/577、ERK1/2 磷酸化水平。结果1.荧光显微镜显示慢病毒转染效率大于80%,实时荧光定量PCR和Western blot结果显示上调组Grb2表达明显增多,下调组Grb2表达明显降低。2.周期性机械应力条件下,Grb2上调组细胞数目最多,增殖能力最强,二型胶原和蛋白聚糖分泌最为旺盛;下调Grb2则削弱了周期性机械应力激活软骨细胞的作用。上调Grb2可增强周期性应力下软骨细胞内FAK-Tyr397、FAK-Tyr576/577、ERK1/2 的磷酸化,下调 Grb2 则可以降低 FAK-Tyr397、FAK-Tyr576/577、ERK1/2 的磷酸化。结论衔接蛋白Grb2在周期性机械应力在软骨细胞内信号转导的过程中扮演了重要角色,参与了应力条件下整合素介导的FAK-Tyr397和FAK-Tyr576/577的激活过程,最终促进ERK1/2的磷酸化,从而发挥了促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成的作用。