【摘 要】
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目的:探究马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei,T.marneffei）感染THP-1细胞后对THP-1细胞CD86蛋白表达情况的影响以及潜在机制的讨论。方法:1、从皮肤软组织感染患者皮损组织中分离得到真菌菌株,分别在27℃及37℃培养该组织分离株并对其形态进行鉴定;2、提取该分离株DNA,进行PCR扩增及产物琼脂糖凝胶电泳,对PCR扩增产物进行测序并在NCBI上进行序列比对
【基金项目】
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项目名称:马尔尼菲篮状菌通过精氨酸代谢诱导巨噬细胞极化的机制,项目合同编号:81760564,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2018.01-2021.12
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目的:探究马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei,T.marneffei）感染THP-1细胞后对THP-1细胞CD86蛋白表达情况的影响以及潜在机制的讨论。方法:1、从皮肤软组织感染患者皮损组织中分离得到真菌菌株,分别在27℃及37℃培养该组织分离株并对其形态进行鉴定;2、提取该分离株DNA,进行PCR扩增及产物琼脂糖凝胶电泳,对PCR扩增产物进行测序并在NCBI上进行序列比对;3、免疫印迹法和免疫电镜法检测分离株菌体CD86表达;4、使用佛波肉豆蔻醋酸（PMA）将THP-1细胞诱导分化为THP-1-Mφ巨噬细胞,使用LPS+IFN-γ诱导Mφ巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞。构建M1型巨噬细胞单独培养、M1型巨噬细胞与T.marneffei分生孢子共培养模型。使用免疫印迹法检测单独培养和共培养模型24、48、72小时CD86和CD206在巨噬细胞上的变化情况;5、使用免疫荧光法检测单独培养和共培养模型24、48、72小时CD86在巨噬细胞膜上的荧光强度;6、使用酶联免疫吸附法检测单独培养和共培养模型24、48、72小时CD86蛋白在巨噬细胞和上清液中的变化情况;7、使用免疫电镜法检测共培养模型中T.marneffei上CD86蛋白的表达情况;8、使用免疫组化法检测共培养模型中T.marneffei上CD86蛋白的表达情况。结果:1、该菌在27℃呈菌丝相,光镜下表现为箒枝状结构,37℃呈酵母相,光镜下表现为短棒状结构;2、PCR扩增产物序列比对结果显示该菌DNA序列与Talaromyces marneffei相似性为99%;3、免疫印迹和免疫电镜均未检测到血液分离株菌体CD86蛋白表达;4、免疫印迹法检测巨噬细胞CD86变化:巨噬细胞CD86随着共培养时间的延长呈现下降趋势,巨噬细胞与T.marneffei分生孢子共培养组在72h时,CD86相对表达量明显低于M1型巨噬细胞单独培养组,P<0.05;巨噬细胞CD206相对表达量在48h共培养组相比于其它时间段升高,72h几乎不表达CD206;5、免疫荧光法检测巨噬细胞CD86变化:CD86随着共培养时间的延长呈现下降趋势,巨噬细胞与T.marneffei分生孢子共培养组在72h时,细胞CD86荧光强度明显低于M1型巨噬细胞单独培养组,P<0.05;6、酶联免疫法检测巨噬细胞和上清液CD86变化:巨噬细胞的CD86随着共培养时间的延长呈现下降趋势,而上清液的CD86随着共培养时间的延长呈现上升趋势,巨噬细胞与T.marneffei分生孢子共培养组在72h时,巨噬细胞CD86表达量明显低于M1型巨噬细胞单独培养组,P<0.05,相反,细胞培养上清液中CD86表达量明显高于M1型巨噬细胞单独培养组,P<0.01;7、免疫电镜法检测共培养组T.marneffei CD86表达:巨噬细胞与T.marneffei分生孢子共培养后T.marneffei上可见特异性的胶体金颗粒;8、免疫组化法检测共培养组T.marneffei CD86表达:巨噬细胞与T.marneffei分生孢子共培养后T.marneffei呈现CD86阳性状态。结论:1、THP-1细胞被T.marneffei感染后CD86表达下降,随着感染时间的延长,逐渐出现M1型巨噬细胞极化不足;2、T.marneffei可能在与THP-1细胞的接触过程中摄取或吸附巨噬细胞产生的CD86,从而导致巨噬细胞CD86的消耗。
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