目的:构建一种同时表达sh RNA和蛋白质的双功能慢病毒表达载体,并利用该载体研究TFIIAγ基因突变对基因转录的影响。方法:1.利用基因克隆方法对原载体p LV-U6-sh RNA-EGFP-Puro进行改造,获得能够同时表达shRNA和蛋白质的慢病毒表达载体。2.分别将干扰beta-tubulin表达的sh RNA和HA-beta-tubulin融合基因克隆于双功能载体上,并对该载体的功能进行鉴定。3.将干扰TFIIAγ表达的sh RNA和携带HA标签的TFIIAγ野生型或突变体融合基因克隆于同一双功能载体上,确定该载体是否能够表达外源基因同时将内源基因敲低;利用表达外源TFIIAγ野生型和突变体稳定细胞系研究TFIIAγ野生型和突变体对基因转录调节的差异及其机制。结果:1.Western blot和荧光显微镜结果表明,通过对原载体进行突变、插入多克隆位点(MCS)和CMV启动子序列后并未影响原载体的基本功能,但增加了改造后的载体一个新功能即蛋白表达功能;提示双功能慢病毒表达载体成功建立。2.利用双功能慢病毒表达载体能同时表达TFIIAγsh RNA和HA-TFIIAγ融合基因表明,该载体能够在293T细胞中表达外源HA-TFIIAγ蛋白同时将内源TFIIAγ表达沉默。3.利用既可表达外源HA-TFIIAγ(或其突变体)又能将内源TFIIAγ沉默的稳定细胞系完成报告基因实验,结果表明,TFIIAγ突变促进Ad ML启动子基础转录活性。利用人类自然启动子指导的报告基因表达载体转染TFIIAγ野生型和突变体稳定细胞系,结果表明,TFIIAγ突变特差异性地调节不同启动子的转录活性。4.Protein-DNA结合实验表明,TFIIAγ突变增加TFIIAγ与Ad ML启动子的结合。结论:我们构建的慢病毒双功能表达载体能够同时表达sh RNA和蛋白质,能够成功用于TFIIAγ基因定点突变的研究。因此,这一新方法为基因定点突变研究提供一个简单快速的新途径。