【摘 要】
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MSTN是控制肌肉生长的负调控因子,也是近些年重点研究的影响畜禽瘦肉率、改善肌肉品质的重要调控基因。Mef2C基因属于Mef2家族,参与骨骼肌肌纤维形成,且促进慢肌纤维的形成。为获得肉质鲜美且能稳定遗传表达的转基因鸡,本实验采用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建MSTN基因Cas 9敲除载体、MEF2C基因的g RNA-Cas9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体,从细胞水平到动物个体
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MSTN是控制肌肉生长的负调控因子,也是近些年重点研究的影响畜禽瘦肉率、改善肌肉品质的重要调控基因。Mef2C基因属于Mef2家族,参与骨骼肌肌纤维形成,且促进慢肌纤维的形成。为获得肉质鲜美且能稳定遗传表达的转基因鸡,本实验采用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建MSTN基因Cas 9敲除载体、MEF2C基因的g RNA-Cas9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体,从细胞水平到动物个体开展CRISPR/Cas 9编辑鸡的方法研究。首先在已有的MSTN基因Cas 9敲除载体、Mef2C基因的g RNA-Cas9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体的基础上,分离鸡原代成肌细胞,分别进行转染。转染后对生肌调节因子进行定量分析,观察Ed U和CCK8细胞增殖情况,结果表明MSTN基因Cas 9敲除载体使MSTN基因表达下调,而生肌调节因子My F5和Myo D表达上调,Ed U和CCK8细胞增殖检测结果均显示敲除MSTN基因促进成肌细胞增殖;Mef2C基因的g RNA-Cas 9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体使Mef2C基因表达显著上调,生肌调节因子My F5、Myo D和My HC表达上调,Ed U和CCK8细胞增殖检测结果均显示插入Mef2C基因促进成肌细胞增殖。Mef2C基因的g RNA-Cas 9插入真核表达载体和Mef2C基因打靶载体促进细胞增殖效果比MSTN基因Cas 9敲除载体更好。把鸡精子细胞在精液稀释液中进行培养和转染,并统计1-6小时精子细胞活力,转染6小时后发现鸡精子细胞发出绿色荧光并发现6小时后仍有部分精子细胞具有活力。在DF-1细胞的脂质体转染和电转染的对比中,发现电转染效果优于脂质体转染效果。根据Neon?Transfection System电转仪摸索精子细胞电转染最佳条件,并进行动物实验,分别使用了脂质体精子载体法、电转染精子法和显微注射慢病毒的方法进行转基因鸡制备实验,但没有获得CRISPR/Cas 9编辑小鸡。
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