论文部分内容阅读
背景在真核生物细胞中,溶酶体是细胞内基本的消化器官,其腔内维持酸性环境,PH约为5,内含50多种水解酶来降解吞噬进来的物质。据报道,溶酶体酸化机制失调是许多溶酶体贮积病（LSDs）、退行性疾病的发病机理。溶酶体酸性机制由V-ATPase复合体调节,质子泵由ATP驱动,存在于真核生物的胞内和细胞膜上,主要负责建立和维持细胞内的酸性PH,并以ATP依赖的方式将H﹢注入细胞腔内。V-ATPase是溶酶体膜上的可逆组装V1/V0质子泵,是一个多亚基复合体,包括位于细胞质的V1复合体和锚定于溶酶体膜上的V0复合体。V1包括至少八个不同的亚基（A-H）,ATP水解的三个催化位点由A和B亚基组成,V0区包含亚基a、c、c’、c"、d和e,负责质子跨膜转运。ATP6V1A基因编码V-ATPase质子泵的一个组成成分,即定位于质子泵上V1区的A亚基。前期实验中,我们发现HSF4通过维持溶酶体酸性PH,上调溶酶体活性。HSF4调控晶状体上皮细胞中小热休克蛋白（比如,HSP25和CRYAB）的表达。HSP 25和alpha B-crystallin作为分子伴侣,在蛋白质质量控制的各个方面发挥着作用,对维持细胞内稳态和存活非常关键。尽管我们已经初步验证alpha B-crystallin与ATP6V1A存在相互作用,但是alpha B-crystallin与ATP6V1A相互作用的功能,及调节溶酶体酸化的分子机制还不了解。通过本课题,我们深入探讨这一分子机制。目的本课题以敲除和过表达Hsf4b,以及敲除alpha B-crystallin的小鼠晶状体上皮细胞株mlec/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB为研究对象,探讨alpha B-crystallin与ATP6V1A相互作用调控溶酶体酸性PH的分子机制。方法1、在mlec/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB细胞株中,用Western blot检测ATP6V1A蛋白水平的表达,用Real time PCR检测ATP6V1A mRNA水平的表达;2、用CHX处理mlec/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB细胞株,Western blot检测ATP6V1A的蛋白稳定性;3、分别用CHX、CQ和MG132处理mlec/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB细胞,Western blot检测ATP6V1A的蛋白降解途径;4、MG132处理mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB细胞后,用免疫沉淀ATP6V1A,Western blot检测Ubiquitin来明确ATP6V1A的泛素化水平;用MG132处理mlec/HA-Hsf4b和mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB,Ubiquitin-beads Pull down实验后,Western blot检测ATP6V1A来研究其泛素化水平;5、在mlec/Hsf4b-/-和mlec/HA-Hsf4b细胞中,通过溶酶体分离实验,检测alpha B-crystallin与ATP6V1A在溶酶体内的表达,用免疫荧光检测alpha B-crystallin和ATP6V1A的亚细胞定位方式;6、运用GST Pull down探究alpha B-crystallin与V-ATPase质子泵的其它亚基的相互作用;7、构建了alpha B-crystallin的4个截短体,NT（1-66aa）、CD（66-149aa）、CC（149-176aa）、CT（66-176aa）,运用GST Pull down探究ATP6V1A与alpha B-crystallin各截短体的相互作用;8、构建PEBG-αB-S19A、PEBG-αB-S45A和PEBG-αB-S59A三个alpha B-crystallin磷酸化位点突变质粒,用GST Pull down检测alpha B-crystallin各突变体与ATP6V1A的相互作用;溶酶体探针Green DND-189孵育后,用多功能酶标仪检测alpha B-crystallin磷酸化位点突变后的溶酶体PH;9、RAPA抑制m TORC1活性后,运用GST Pull down探讨对ATP6V1A与alpha B-crystallin的相互作用产生的影响;用CHX和RAPA共同处理mlec/HA-Hsf4b细胞后,Western blot检测m TORC1抑制后ATP6V1A的蛋白稳定性;利用溶酶体探针Green DND-189,多功能酶标仪检测RAPA处理后的mlec/HA-Hsf4b细胞的溶酶体PH。结果、1、在晶状体上皮细胞中,过表达HSF4b增强蛋白的稳定性;2、敲除alpha B-crystallin明显降低HSF4介导的ATP6V1A的蛋白稳定性;3、Alpha B-crystallin缺失促进ATP6V1A的泛素化,促其通过泛素蛋白酶体途径降解;4、ATP6V1A与alpha B-crystallin共分布于溶酶体上;5、Alpha B-crystallin只与ATP6V1A亚基相互作用;6、Alpha B-crystallin的各截短体与ATP6V1A无相互作用,磷酸化修饰也不参与其与ATP6V1A的相互作用;7、Alpha B-crystallin参与m TOR介导的V-ATPase质子泵对溶酶体活性的调控。结论1、晶状体上皮细胞中,ATP6V1A蛋白的降解主要是通过泛素蛋白酶体途径,alpha B-crystallin通过与ATP6V1A相互作用增强其蛋白稳定性。2、Alpha B-crystallin不结合V-ATPase质子泵其它亚基,仅与ATP6V1A相互作用,alpha B-crystallin与ATP6V1A相互作用依赖其全长,且alpha B-crystallin的磷酸化修饰也不参与二者相互作用这一过程中。3、Alpha B-crystallin参与m TOR介导的V-ATPase质子泵对溶酶体活性的调控。