【摘 要】
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花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）为芸香科花椒属植物,是我国重要的经济林木,也是药食同源植物,具有很高的食用、药用和生态价值。花椒麻味素和黄酮类化合物因其独特的风味和特殊的生理活性,可作为花椒种质资源评价的重要标志性成分。但现有品质评价主要以花椒外观品质及挥发油含量为标准,很难全面真实的体现花椒的药食同源整体效应。本文采用~1H-NMR技术、转录组测序技术和EST-S
【基金项目】
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国家自然科学基金项目-基于~1H-NMR 代谢组学和转录组学的花椒种质资源研究（编号:31872706）；
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花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）为芸香科花椒属植物,是我国重要的经济林木,也是药食同源植物,具有很高的食用、药用和生态价值。花椒麻味素和黄酮类化合物因其独特的风味和特殊的生理活性,可作为花椒种质资源评价的重要标志性成分。但现有品质评价主要以花椒外观品质及挥发油含量为标准,很难全面真实的体现花椒的药食同源整体效应。本文采用~1H-NMR技术、转录组测序技术和EST-SSR分子标记技术,针对麻味素和黄酮类化合物这两种代谢标识物对9个花椒种质进行品质评价与分析。主要研究结果如下:1.首次建立了~1H-NMR定量分析花椒麻味素和黄酮的方法。以吡嗪为内标物,用CDCl3溶解85%乙醇粗提物进行麻味素核磁分析,以麻味素酰胺键上的氢质子（δ:6.33 ppm,三重峰）为定量信号峰;用乙酸乙酯和丙酮依次萃取85%乙醇粗提物获得黄酮提取物,经CD3COCD3-d6溶解进行黄酮核磁分析,以黄酮6′-H（δ7.40、δ7.57、δ7.62、δ8.01 ppm）作为定量信号峰。经方法学验证,加样回收率达到97%以上,其精密度、稳定性、重复性良好（RSD均小于3%）。2.采用~1H-NMR定量和HPLC法对不同种质花椒的麻味素和黄酮含量进行了动态分析,进一步验证了~1H-NMR定量方法的有效性。结果表明,以麻味素和黄酮类化合物总含量为依据,韩城狮子头果壳的最佳采摘期为7月份,凤县大红袍、韩城陈家仡佬无刺、韩城大红袍、韩城无刺、秦安1号和武都大红袍的最佳采摘期为8月份,府谷花椒和西农无刺的最佳采摘期为9月。3.构建了不同种质花椒~1H-NMR指纹图谱,并对其进行了化学计量学分析（SA、HCA、PCA及DA）。9个花椒种质分为3组:第1组包含3个种质,为无刺组,即韩城陈家仡佬无刺、韩城无刺和西农无刺,其麻味素及黄酮类化合物含量均较高,质量较好;第2组包含5个种质,即凤县大红袍、武都大红袍、韩城大红袍、秦安1号和韩城狮子头;第3组包含1个种质,即府谷花椒,麻味素含量及黄酮类化合物含量均较低。综合以上结果,韩城无刺为最优种质。4.通过转录组测序分析,筛选出27个与黄酮类化合物合成有关的差异基因。结合差异基因的差异表达倍数,鉴定出其中10条可能引起花椒黄酮类化合物差异性的基因:c100778.graph＿c0、c103584.graph＿c0、c103637.graph＿c0、c103908.graph＿c0、c107987.graph＿c0、c96219.graph＿c0、c96857.graph＿c0、c97975.graph＿c1、c98433.graph＿c1和c99880.graph＿c0。通过q RT-PCR验证,除c96857.graph＿c0外,其它9个基因的相对表达量均与转录组结果一致。5.针对筛选出的麻味素及黄酮类化合物的合成差异基因,设计开发EST-SSR专用引物,从分子水平揭示不同种质花椒遗传多样性差异。从36对引物组合中筛选出16对引物组合,共扩增出94个条带,多态性比率达到98.94%。遗传多样性分析结果表明,多态位点比率均值为82.51%;Nei’s遗传多样性指数（H）均值为0.3494;Shannon’s信息指数（I）均值为0.6103。综合分析,韩城大红袍遗传多样性水平最高,凤县大红袍最低,遗传变异主要出现在种质内部。UPGMA聚类分析和PCo A聚类分析将9个种质分为3组:第1组为凤县大红袍和武都大红袍;第2组为西农无刺、韩城狮子头、韩城无刺和韩城陈家仡佬无刺;第3组为府谷花椒、韩城大红袍和秦安1号。后两组中的种质遗传多样性水平较高。EST-SSR指纹图谱表明,有特征条带可对9个种质花椒进行区分。6.对不同种质花椒麻味素及黄酮类化合物含量与其遗传多样性指数进行相关性分析。结果表明,不同种质花椒遗传多样性指数与麻味素和黄酮类化合物含量均呈负相关,其中麻味素含量与有效等位基因数相关性显著（Pearson相关系数为-0.696）,表明麻味素含量差异受相关表达基因调控更显著。
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