细胞内存在的各种生物分子都具有特殊的生理功能,并且对生命过程起着至关重要的作用。准确、灵敏地获取活细胞内生物分子的相关信息对揭示细胞内生物分子相互作用的规律和机制、重大疾病发生发展机制及其治疗等都具有十分重要的意义。迄今,多种基于纳米材料而构建的新型荧光探针已经被广泛应用于细胞内重要生物分子的检测与成像。然而目前活细胞内生物分子的在线研究仍然存在着诸多问题。本论文针对活细胞内生物分子检测的相关问题,发展了几种基于金纳米颗粒的新型荧光核酸探针,主要内容包括:一、“FRET nanoflares”探针用于活细胞内肿瘤相关mRNA的检测发展了一种名为FRET nanoflares的新型细胞内检测探针。首先将双色荧光染料标记的发卡型flares链和识别链通过DNA杂交的方式固定在金纳米颗粒表面。在没有目标物时,flares链与识别链杂交,使荧光供体和荧光受体远离,FRET效率低。当有目标mRNA存在时,目标物与识别链杂交形成双螺旋结构将flares链从金颗粒表面竞争下来,flares链恢复发卡结构,使荧光供体和荧光受体互相靠近发生FRET效应,荧光比值发生变化。通过测定供受体之间的荧光比值,就可以实现目标mRNA的检测。与传统的单标型nanoflares探针相比,FRET nanoflares探针能避免因温度或者细胞内化学物质(核酶、谷胱甘肽等)而引起的假阳性信号,同时FRET nanoflares产生的比率型荧光信号,可以最大限度地降低系统误差。二、基于aptamer的FRET nanoflares用于细胞内钾离子的检测在前述工作的基础上,结合核酸适配体,发展了一种基于aptamer的FRET nanoflares探针用于细胞内钾离子的检测。该探针包括金纳米颗粒、短链DNA和双荧光标记的核酸适配体。巯基标记的互补DNA短链与核酸适配体杂交,并通过金巯键修饰在金颗粒表面。在没有钾离子存在的情况下,核酸适配体被DNA短链捕获,供体荧光基团和受体荧光基团远离,不能发生FRET效应;有钾离子存在的情况下,核酸适配体与钾离子结合并且离开短链DNA,形成G-四聚体结构使两末端靠近,使得修饰在核酸适配体链两末端的供体荧光基团和受体荧光基团互相靠近,发生FRET效应。通过检测供受体之间的荧光比值变化就可以获取钾离子的浓度信息。实验证明该探针可进入细胞内部对钾离子进行检测和成像。三、基于核酸适配体核酶和金纳米颗粒的荧光探针用于细胞内ATP的放大检测构建了一种基于核酸适配体核酶的金颗粒荧光探针用于活细胞内生物分子的高灵敏检测。在这一设计中,核酸适配体核酶与底物链杂交后修饰在金颗粒表面,此时核酶处于失活状态。只有目标物分子与核酸适配体结合能够激活核酸适配体核酶,催化切割底物链,使得荧光标记的短链远离金纳米颗粒表面,体系荧光增强。一个目标物激活的核酸适配体核酶能够切割多条修饰在金颗粒表面的底物链,实现荧光信号的放大。结果表明,这一方法的检测限为200 nM,与其他传统的基于ATP核酸适配体构建的用于细胞内检测的探针相比,该方法在灵敏度上提高了2-3个数量级。而且,实验结果表明这一探针能够直接进入细胞内,实现对活细胞内ATP的高灵敏检测。四、基于金纳米颗粒的发卡封闭型脱氧核酶探针用于细胞内miRNA的放大检测发展了一种基于金纳米颗粒的发卡封闭型脱氧核酶探针用于细胞内miRNA的传感。该探针由金纳米颗粒和发卡封闭型脱氧核酶长链两部分组成,发卡封闭型脱氧核酶长链包含识别链、polyA、linker、脱氧核酶及底物。在没有目标物时,发卡封闭型脱氧核酶链通过polyA和linker之间的杂交形成发卡结构,使得脱氧核酶的活性被抑制,荧光基团靠近金颗粒表面,荧光被淬灭。在有目标物存在的情况下,识别链与目标物进行杂交使得发卡被打开,脱氧核酶形成活性结构,在辅助因子镁离子的协助下对底物部分进行切割,其切割产物与目标物分离,致使荧光基团远离金颗粒表面,荧光得以恢复。同时,被释放的目标物与其他发卡封闭型脱氧核酶链上的识别链杂交,开启下一轮切割循环反应。以这种方式,每条目标miRNA可以多次循环利用,使多条发卡封闭型脱氧核酶链被切割,从而实现放大检测的目的。此外,该探针还能进入活细胞内,实现活细胞内miRNA的放大检测。