随着气候变暖和近海的富营养化,全球海洋,包括我国近海水母爆发日益频繁[1]。有毒水母伤人事件逐年上升,水母蜇伤成为最常见的海洋生物伤[2]。研究表明,水母毒素是一类结构新颖的肽类毒素,相对分子质量从10～600 kDa不等。水母毒素的生物活性广泛,包括心血管毒性、溶血毒性、神经肌肉毒性与皮肤毒性等[3],其中心血管毒性是水母蜇伤致死的主要原因。近年来有很多关于水母毒素心血管毒性研究的报道,但大多数仍以粗毒为研究对象。目前尚无水母心血管毒性蛋白成功纯化与鉴定的报道,这与水母毒素本身的特性有关。由于水母毒素不稳定,易分解[4],在纯化过程中活性丧失明显,严重阻碍了其分离纯化和作用机理的研究。水母毒素心血管毒性蛋白的分离纯化已经成为水母毒素研究的主要难点之一。本论文以我国东海采集的代表性有毒水母——发形霞水母(Cyanea capillata, C. capillata)为研究对象,第一步研究水母触手提取物和刺丝囊毒素的制备方法,获取合适的用于心血管毒性蛋白分离纯化的粗毒样品;第二步通过测定所选样品的毒性变化,确定在纯化阶段各组分活性监测时的合适剂量,并分析常用缓冲液对纯化样品活性的影响,优化纯化过程中最佳缓冲液的选择。第三步先用盐析、超滤等方式预处理TOE,再综合利用离子交换层析、凝胶过滤层析等色谱等方法进行分离纯化,利用心血管毒性检测模型监测各组分活性,聚丙烯凝胶电泳检测活性组分中的蛋白成分;最后,利用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术完成对分离到的活性蛋白一级结构的测定,并对它们的序列特点及生物活性进行分析。方法第一部分:触手提取物和刺丝囊毒素的制备经过自溶、过滤、离心等步骤制备C. capillata的触手提取物(tentacle-only extract, TOE)和刺丝囊(nematocyst)。观察不同自溶时间对触手的自溶率和刺丝囊获得量的影响。通过光学显微镜观察C. capillata刺丝囊的形态特点并进行分析。比较反复冻融、玻璃匀浆、组织破碎仪破碎等方式破碎刺丝囊囊壁制备刺丝囊毒素(Nematocyst venom, NV)的效果。测定并比较TOE和NV两者心血管毒性和溶血活性,并通过SDS-PAGE比较两者蛋白成分差异。综合评定后确定用于后续分离纯化的粗毒样品。第二部分:触手提取物的毒性研究改良寇氏法测定TOE对昆明种小鼠尾静脉注射的LD50:取昆明种小鼠108只,雌雄各半,随机分成9组,每组12只,禁食12 h后按0.1 ml/10 g体重尾静脉注射TOE,连续7 d密切观察并记录小鼠的摄食、行为、排泄物、中毒/死亡情况。Sprague-Dawley (SD)大鼠颈外静脉插管给药,股动脉插管监测血压变化分析不同浓度的TOE心血管毒性,完成TOE对SD大鼠致死临界值Dt的初步测定,为后续纯化组分活性测定提供给药剂量参考。并将TOE浸没在常用的几种阴阳离子交换缓冲液过夜透析,测定其对大鼠心肌细胞的致死毒性。第三部分:TOE的分离纯化及鉴定先用硫酸铵沉淀和超滤的方式预处理TOE,除去大量的杂蛋白,得出可能的目标蛋白的分子量范围,然后以BioLogic DuoFlow (Bio-Rad公司)和?KTA Purifier(GE Healthcare)蛋白纯化系统为主要技术平台,综合利用凝胶过滤、离子交换层析等多种方法,分离纯化C. capillata TOE粗毒。SD大鼠颈外静脉插管给药、股动脉插管监测血压变化来分析各组分心血管毒性,SDS-PAGE分析各组分蛋白成分,进一步指导心血管毒性组分的分离纯化。得到目标蛋白的单一条带后利用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术完成对其一级结构的测定,并对它们的序列特点及可能存在的生物活性进行初步分析。结果第一部分:触手提取物和刺丝囊毒素的制备通过自溶、过滤、离心等方式能成功分离得到C. capillata的触手提取物和刺丝囊。水母触手不同的自溶时间会影响触手的溶解率。在触手自溶实验中,0 h组是以超声破碎的方式帮助触手自溶,2 h组玻璃棒不间断搅拌,所以这两组未溶解的触手的量较4~48 h组要少一些,同样得到的刺丝囊的量要多一些。48 h、96 h (m/v, 1:1)、96 h (m/v, 1:2)以及96 h (m/v, 1:3)几组未溶的触手较少。在96 h (m/v, 1:1)获得的刺丝囊质量最多。综上所述,发形霞水母触手自溶的最佳条件为:在触手质量与无菌海水体积比为1:1的环境中自溶96 h。刺丝囊的显微镜观察结果显示刺丝囊包含两个部分:刺丝囊囊腔和内部的刺丝。C. capillata刺丝囊从形状上可分为香蕉形和椭圆形,以香蕉形为主。在提取NV过程中,反复冻融对刺丝囊囊壁的破坏较小,而采用玻璃匀浆器匀浆的方式能有效破碎大部分刺丝囊,获得NV。TOE和NV两者均具有较强的溶血活性,溶血活性剂量曲线呈“S”形。在心血管毒性方面,相同剂量的TOE的活性要明显强于NV。TOE和NV的电泳结果显示,TOE蛋白条带比NV的蛋白条带多且明显。第二部分:触手提取物的毒性研究测得TOE对昆明种小鼠尾静脉注射的LD50剂量为4.244 mg/kg,95%的可信限为3.679 mg/kg-4.862 mg/kg,小鼠的症状呈现剂量依耐性。低剂量组(<5 mg/kg)小鼠表现为精神萎靡、四肢乏力、行动迟缓、蜷缩等症状,部分小鼠于48 h内死亡,死亡动物解剖,肉眼观察小鼠的肺呈鲜红色,有水肿、淤血等症状;心脏略肿大。超过48 h未死亡者逐渐恢复至正常状态,连续观察7 d,小鼠摄食、活动和大小便均正常,无特殊分泌物,处死动物解剖肉眼观察,主要脏器未见异常。中剂量组(5~10 mg/kg)小鼠表现为精神萎靡、四肢乏力、行动迟缓,部分出现肌颤、蜷缩等症状,早期还伴随着呼吸加深、加快表现,随着时间延长逐渐减弱,最后出现陈-施式呼吸而死亡,死亡时间大约在2 h左右。死亡动物解剖,肉眼观察肺出现水肿、淤血等症状,心脏基本正常。高剂量组(>10 mg/kg)小鼠迅速出现呼吸加深、加快表现,1 min左右逐步出现全身性肌颤、双下肢抽搐、全身性惊厥、角弓反张等中枢神经系统典型症状。小鼠大多在5 min内死亡,死亡时伴有大小便失禁。死亡动物解剖,肉眼观察肺和心脏基本正常。TOE对SD大鼠致死估计临界值Dt约为0.8 mg/kg。静脉注射TOE后30 s内会迅速产生一个轻微而短暂的升血压反应,而后伴随着剧烈的血压下降。0.7 mg/kg剂量组的大鼠在1 min至2 min期间血压下降最明显,5 min左右血压达到最低值(约40 mmHg)。随着时间的推移,血压逐渐恢复,30 min后基本稳定,可恢复至80 mmHg左右。0.8 mg/kg剂量组的大鼠在0.5 min至2 min期间血压下降明显,2 min后血压继续下降,持续观察发现部分大鼠血压会逐渐的恢复至70 mmHg左右,另有部分大鼠则在20 min左右死亡。0.9 mg/kg剂量组的大鼠1 min至2 min期间血压下降明显,伴随着剧烈的抽搐,血压持续下降,20 min至40 min期间陆续死亡。以此估计,TOE对SD大鼠致死估计临界值Dt约为0.8 mg/kg。第三部分:TOE的分离纯化及鉴定使用硫酸铵沉淀法和超滤法处理C. capillata TOE,初步锁定一27 kDa的蛋白为可能的心血管毒性组分。再通过阴阳离子交换色谱柱及凝胶过滤色谱柱进一步对毒素进行分离纯化,最终确定27 kDa的条带蛋白是C. capillata TOE中存在的心血管毒性蛋白,并利用MALDI-TOF质谱技术解析27 kDa条带蛋白的一级结构。结论C. capillata TOE具有与NV相当或略强于NV的心血管毒性。相比较而言,TOE的制备较NV的制备操作简单,且可获得的样品量大,是分离纯化心血管毒性蛋白的合适样品。TOE具有很强的毒性,对昆明种小鼠尾静脉注射的半数致死剂量(LD50)为4.244 mg/kg,对SD大鼠的致死估计临界值Dt值约为0.8 mg/kg。采用盐析、超滤以及离子交换等方法纯化TOE中心血管活性蛋白,结合活性监测和SDS-PAGE分析,确定27 kDa的条带蛋白是C. capillata TOE中存在的心血管毒性蛋白。