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随着人口老龄化的不断发展，心肌梗死后心力衰竭已经成为威胁人类健康的主要因素。心肌梗死后心衰以心脏交感神经末梢密度和功能降低以及心室重构为主要特征。心衰时活性氧基团(ROS)的增高。NADPH氧化酶是ROS的主要来源之一。心肌梗死后心衰时NADPH氧化酶活性增加。心衰时心脏交感神经末梢密度减少和功能异常。然而，NADPH氧化酶源性ROS是否介导梗死后心衰心脏交感神经末梢异常以及心室重构则尚未完全阐明。因此，本课题从这个问题入手，第一部分在心梗诱导心衰兔模型上，探究是否NADPH氧化酶激活介导心脏交感神经末梢异常。神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)对神经元及其末梢的生长，发育，分化和再生发挥重要的调节作用。前期研究发现NGF在心肌细胞中表达，心衰时心肌细胞NGF表达降低，并与心脏交感神经末梢密度减少和功能异常有关。然而，心梗后心衰时心肌细胞NGF的降低是否与ROS增加有关不清楚。本课题第二部分，在心梗诱导心衰兔模型上，首先观察心衰过程中心肌细胞NGF的变化及其与ROS和心肌重构的关系。第三部分，采用NADPH氧化酶抑制剂干预，进一步探讨是否NADPH氧化酶源性的ROS介导了心肌梗死后心衰时NGF的下调，进而促进心肌重构和心衰。为了进一步阐明其分子机制，本课题第四部分在细胞水平，观察在离体心肌细胞培养模型上缺氧对NGF表达的影响。同时观察重组NGF干预对缺氧所致心肌细胞凋亡及其信号通路的影响。
本课题包含以下四部分：
第一部分NADPH氧化酶激活介导心肌梗死后心脏交感神经末梢异常
目的：
研究是否NADPH氧化酶的激活介导了兔心梗后心衰时交感神经末梢减少和功能异常。
方法：
本实验选用新西兰大白兔急性心肌梗死模型，动物分为4组：假手术+生理盐水实验组(sham placebo)、假手术组+apocynin实验组(sham apocynin)、心肌梗死+生理盐水实验组(MI placebo)、心肌梗死+apocynin实验组(MI apocynin)。每个实验组均接受为期30天的生理盐水或NADPH氧化酶抑制剂apocynin(6 mg/kg/day)灌胃给药，最后所有动物均接受心脏超声和血流动力学的检测。之后处死，留取心脏组织，计算梗死面积，称量体重，心脏全重以及各心房心室重和肺湿重、肝湿重。在酶标仪下观察心肌组织NADPH氧化酶活性；组织荧光检测儿茶酚胺表达水平；免疫荧光检测心肌氧化应激水平；免疫组化和WesternBlotting方法检测重要的神经标记物酪氨酸羟化酶和PGP9.5的表达水平；qRT-PCR方法检测交感神经功能和密度相关指标PGP9.5，GAP-43，NET的mRNA表达水平。
结果：
与假手术组相比，兔MIpalcebo组的结果显示左室舒张末期容积(LV EDD)增加；左室缩短分数(LV FS)和LVdP/dt降低。较MI组，MI+apocynin组的左室收缩和舒张功能均得到了改善。MI组在远端非梗死区的心肌细胞呈现4-HNE表达和NADPH氧化酶活性增加，MI+apocynin组较之则均缓解。MI组的心脏儿茶酚胺的组织荧光和酪氨酸羟化酶(TH)和PGP9.5的免疫组化结果提示均降低，MI+apocynin组较之则改善。NET,TH和PGP9.5的蛋白和mRNA表达在MI兔心梗组均下降，而在MI+apocynin组，其下降结果得到缓解。
结论：
NADPH氧化酶抑制剂apocynin减轻兔心梗后心衰时心肌氧化应激增加和心脏交感神经末梢密度和功能的降低。这些结果提示NADPH氧化酶激活介导心衰时心脏交感神经末梢的异常。NADPH氧化酶的抑制可能有利于心衰的治疗。
第二部分心衰过程中心肌细胞NGF的变化及其与ROS和心肌重构的关系
目的：
心衰时心脏神经生长因子(NGF)降低与心脏交感神经末梢减少有关。然而，在MI后心衰时远端非梗死区心肌细胞NGF的改变与氧化应激和心脏重构的潜在关系尚未完全阐明。在本课题第二部分，我们研究了MI后心衰时远端非梗死区心肌细胞NGF的变化及其与心肌氧化应激和左心室重构的关系。
方法：
健康成年雄性新西兰白兔随机分为MI和假手术两组。术后8周进行超声心动图和血流动力学检查，实验末处死，收集组织用于组织学，生化和分子生物学指标测定。H9C2心肌细胞培养，过氧化氢干预，测定NGF表达的变化。
结果：
心肌梗死后心力衰竭模型中远端非梗死区心肌神经生长因子(NGF)表达减少，免疫荧光染色显示NGF在心肌细胞中表达，并且在心肌细胞中表达降低。NGF受体TrkA、酪氨酸羟化酶(TH)和蛋白质基因产物9.5(PGP9.5)远端非梗死区心肌中的表达也降低。神经生长因子(NGF)的表达程度与心肌细胞凋亡及左室舒张末期容积呈负相关，而与心肌细胞自噬及左室dP/dt之间呈正相关。NGF的降低与心肌氧化应激标志物4-HNE的增加有关。在体外培养的H9C2心肌细胞中，过氧化氢干预导致NGF的表达降低。
结论：
心肌梗死后心力衰竭时远端非梗死区心肌细胞NGF的降低与心肌细胞凋亡增加，心肌细胞自噬减少以及左室重构有关。氧化应激介导心肌细胞NGF的降低。这些结果提示应用抗氧化剂预防NGF表达降低的策略可能有益于改善梗死后心衰时左室重构和心功能。
第三部分NADPH氧化酶激活介导MI后心衰时心肌细胞NGF下调致心室重构和心功能不全
目的：
NADPH氧化酶是ROS的主要来源之一。衰竭心肌NADPH氧化酶活性增加和NGF表达降低。在这项研究中，我们探究是否心衰时NADPH氧化酶激活介导心肌细胞NGF的降低，进而导致心肌细胞凋亡和左心室功能障碍。
方法：
本研究采用心肌梗死诱导心力衰竭兔模型。健康成年新西兰白兔随机分为四组：假手术+生理盐水实验组(sham placebo)、假手术组+apocynin实验组(sham apocynin)、心肌梗死+生理盐水实验组(MI placebo)、心梗+apocynin实验组(MI apocynin)。术后1周开始灌胃给予生理盐水或NADPH氧化酶抑制剂apocynin(6 mg/kg/day)治疗四周。在实验末行心脏超声心动图和血流动力学的检测，然后，处死动物，收集组织。非梗死区心肌用于组织学，生化和分子生物学指标测定。测定心肌组织NADPH氧化酶活性，免疫组化分析Nox-5，NGF，TrkA的表达水平及定位；WesternBlotting方法检测NGF和TrkA的蛋白表达水平；qRT-PCR方法检测NGF的mRNA表达水平。TUNEL法测定心肌细胞凋亡。
结果：
与假手术placebo组相比，MIplacebo组的结果显示左室缩短分数(LV FS)和LVdP/dt降低。较MI组，MI+apocynin组的LVFS和LVdP/dt均得到了改善。MIplacebo组，远端非梗死区的心肌NADPH氧化酶活性增加，MI+apocynin组较之则均缓解。免疫组化结果表明，MIplacebo组心肌NADPH氧化酶亚单位Nox-5水平增高，MI+apocynin组Nox5较之减轻。MIplacebo组，心肌NGF蛋白表达和mRNA表达均降低，MI+apocynin组较之则改善。免疫组化和免疫印迹结果表明，TrKA蛋白表达，在MIplacebo组均下降，而在MI+apocynin组，其下降程度得到缓解。TUNEL实验显示MIplacebo组，心肌细胞凋亡增加，而MI+apocynin组较之则明显缓解。
结论：
心肌梗死后心力衰竭时左室收缩功能降低，远端非梗死区心肌NADPH氧化酶活性增加，Nox5表达增加，NGF及其受体TrkA蛋白和mRNA表达均降低，心肌细胞凋亡增加。NADPH氧化酶抑制剂可减轻这些变化。这些结果提示NADPH氧化酶激活介导梗死后心衰时心肌NGF表达降低，进而导致心肌细胞凋亡，心室重构和心功能障碍。
第四部分缺氧诱导离体心肌细胞NGF下降致心肌细胞凋亡
目的：
心梗后心衰时的NADPH氧化酶和NGF的下降有关。本研究第四部分，从细胞水平上，采用H9C2心肌细胞培养模型，首先探究是否缺氧诱导NGF降低，以及NADPH氧化酶是否参与了这个变化。然后，进一步实验证实重组NGF在缺氧诱导心肌细胞凋亡中的作用及其信号通路。
方法：
第一部分细胞分为3组：control组；缺氧组；缺氧+apocynin组。第二部分，细胞分为4组：control组；control+NGF；缺氧组(心肌细胞缺氧后6h)；缺氧+NGF。采用WesternBlotting方法分析NGF，Caspase-3，CleavedCaspase-3，Bcl-2，Bax以及p-Akt的表达水平。
结果：
与正常细胞对照组相比，缺氧导致NGF蛋白表达降低，而NADPH氧化酶抑制剂apocynin干预可缓解缺氧诱导的NGF减低。与单纯缺氧组相比，重组NGF干预可降低Bax和cleavedCaspase-3蛋白表达的水平，增高p-Akt，Bcl-2的表达水平。
结论：
NADPH氧化酶抑制可阻止缺氧诱导的心肌细胞NGF的减少。NGF可通过激活Akt，增加Bcl-2降低Bax和cleavedCaspase-3的表达来抑制细胞凋亡。这些结果提示NADPH氧化酶激活介导心梗后缺氧诱导的NGF表达降低，NGF降低可促进缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
本课题包含以下四部分：
第一部分NADPH氧化酶激活介导心肌梗死后心脏交感神经末梢异常
目的：
研究是否NADPH氧化酶的激活介导了兔心梗后心衰时交感神经末梢减少和功能异常。
方法：
本实验选用新西兰大白兔急性心肌梗死模型，动物分为4组：假手术+生理盐水实验组(sham placebo)、假手术组+apocynin实验组(sham apocynin)、心肌梗死+生理盐水实验组(MI placebo)、心肌梗死+apocynin实验组(MI apocynin)。每个实验组均接受为期30天的生理盐水或NADPH氧化酶抑制剂apocynin(6 mg/kg/day)灌胃给药，最后所有动物均接受心脏超声和血流动力学的检测。之后处死，留取心脏组织，计算梗死面积，称量体重，心脏全重以及各心房心室重和肺湿重、肝湿重。在酶标仪下观察心肌组织NADPH氧化酶活性；组织荧光检测儿茶酚胺表达水平；免疫荧光检测心肌氧化应激水平；免疫组化和WesternBlotting方法检测重要的神经标记物酪氨酸羟化酶和PGP9.5的表达水平；qRT-PCR方法检测交感神经功能和密度相关指标PGP9.5，GAP-43，NET的mRNA表达水平。
结果：
与假手术组相比，兔MIpalcebo组的结果显示左室舒张末期容积(LV EDD)增加；左室缩短分数(LV FS)和LVdP/dt降低。较MI组，MI+apocynin组的左室收缩和舒张功能均得到了改善。MI组在远端非梗死区的心肌细胞呈现4-HNE表达和NADPH氧化酶活性增加，MI+apocynin组较之则均缓解。MI组的心脏儿茶酚胺的组织荧光和酪氨酸羟化酶(TH)和PGP9.5的免疫组化结果提示均降低，MI+apocynin组较之则改善。NET,TH和PGP9.5的蛋白和mRNA表达在MI兔心梗组均下降，而在MI+apocynin组，其下降结果得到缓解。
结论：
NADPH氧化酶抑制剂apocynin减轻兔心梗后心衰时心肌氧化应激增加和心脏交感神经末梢密度和功能的降低。这些结果提示NADPH氧化酶激活介导心衰时心脏交感神经末梢的异常。NADPH氧化酶的抑制可能有利于心衰的治疗。
第二部分心衰过程中心肌细胞NGF的变化及其与ROS和心肌重构的关系
目的：
心衰时心脏神经生长因子(NGF)降低与心脏交感神经末梢减少有关。然而，在MI后心衰时远端非梗死区心肌细胞NGF的改变与氧化应激和心脏重构的潜在关系尚未完全阐明。在本课题第二部分，我们研究了MI后心衰时远端非梗死区心肌细胞NGF的变化及其与心肌氧化应激和左心室重构的关系。
方法：
健康成年雄性新西兰白兔随机分为MI和假手术两组。术后8周进行超声心动图和血流动力学检查，实验末处死，收集组织用于组织学，生化和分子生物学指标测定。H9C2心肌细胞培养，过氧化氢干预，测定NGF表达的变化。
结果：
心肌梗死后心力衰竭模型中远端非梗死区心肌神经生长因子(NGF)表达减少，免疫荧光染色显示NGF在心肌细胞中表达，并且在心肌细胞中表达降低。NGF受体TrkA、酪氨酸羟化酶(TH)和蛋白质基因产物9.5(PGP9.5)远端非梗死区心肌中的表达也降低。神经生长因子(NGF)的表达程度与心肌细胞凋亡及左室舒张末期容积呈负相关，而与心肌细胞自噬及左室dP/dt之间呈正相关。NGF的降低与心肌氧化应激标志物4-HNE的增加有关。在体外培养的H9C2心肌细胞中，过氧化氢干预导致NGF的表达降低。
结论：
心肌梗死后心力衰竭时远端非梗死区心肌细胞NGF的降低与心肌细胞凋亡增加，心肌细胞自噬减少以及左室重构有关。氧化应激介导心肌细胞NGF的降低。这些结果提示应用抗氧化剂预防NGF表达降低的策略可能有益于改善梗死后心衰时左室重构和心功能。
第三部分NADPH氧化酶激活介导MI后心衰时心肌细胞NGF下调致心室重构和心功能不全
目的：
NADPH氧化酶是ROS的主要来源之一。衰竭心肌NADPH氧化酶活性增加和NGF表达降低。在这项研究中，我们探究是否心衰时NADPH氧化酶激活介导心肌细胞NGF的降低，进而导致心肌细胞凋亡和左心室功能障碍。
方法：
本研究采用心肌梗死诱导心力衰竭兔模型。健康成年新西兰白兔随机分为四组：假手术+生理盐水实验组(sham placebo)、假手术组+apocynin实验组(sham apocynin)、心肌梗死+生理盐水实验组(MI placebo)、心梗+apocynin实验组(MI apocynin)。术后1周开始灌胃给予生理盐水或NADPH氧化酶抑制剂apocynin(6 mg/kg/day)治疗四周。在实验末行心脏超声心动图和血流动力学的检测，然后，处死动物，收集组织。非梗死区心肌用于组织学，生化和分子生物学指标测定。测定心肌组织NADPH氧化酶活性，免疫组化分析Nox-5，NGF，TrkA的表达水平及定位；WesternBlotting方法检测NGF和TrkA的蛋白表达水平；qRT-PCR方法检测NGF的mRNA表达水平。TUNEL法测定心肌细胞凋亡。
结果：
与假手术placebo组相比，MIplacebo组的结果显示左室缩短分数(LV FS)和LVdP/dt降低。较MI组，MI+apocynin组的LVFS和LVdP/dt均得到了改善。MIplacebo组，远端非梗死区的心肌NADPH氧化酶活性增加，MI+apocynin组较之则均缓解。免疫组化结果表明，MIplacebo组心肌NADPH氧化酶亚单位Nox-5水平增高，MI+apocynin组Nox5较之减轻。MIplacebo组，心肌NGF蛋白表达和mRNA表达均降低，MI+apocynin组较之则改善。免疫组化和免疫印迹结果表明，TrKA蛋白表达，在MIplacebo组均下降，而在MI+apocynin组，其下降程度得到缓解。TUNEL实验显示MIplacebo组，心肌细胞凋亡增加，而MI+apocynin组较之则明显缓解。
结论：
心肌梗死后心力衰竭时左室收缩功能降低，远端非梗死区心肌NADPH氧化酶活性增加，Nox5表达增加，NGF及其受体TrkA蛋白和mRNA表达均降低，心肌细胞凋亡增加。NADPH氧化酶抑制剂可减轻这些变化。这些结果提示NADPH氧化酶激活介导梗死后心衰时心肌NGF表达降低，进而导致心肌细胞凋亡，心室重构和心功能障碍。
第四部分缺氧诱导离体心肌细胞NGF下降致心肌细胞凋亡
目的：
心梗后心衰时的NADPH氧化酶和NGF的下降有关。本研究第四部分，从细胞水平上，采用H9C2心肌细胞培养模型，首先探究是否缺氧诱导NGF降低，以及NADPH氧化酶是否参与了这个变化。然后，进一步实验证实重组NGF在缺氧诱导心肌细胞凋亡中的作用及其信号通路。
方法：
第一部分细胞分为3组：control组；缺氧组；缺氧+apocynin组。第二部分，细胞分为4组：control组；control+NGF；缺氧组(心肌细胞缺氧后6h)；缺氧+NGF。采用WesternBlotting方法分析NGF，Caspase-3，CleavedCaspase-3，Bcl-2，Bax以及p-Akt的表达水平。
结果：
与正常细胞对照组相比，缺氧导致NGF蛋白表达降低，而NADPH氧化酶抑制剂apocynin干预可缓解缺氧诱导的NGF减低。与单纯缺氧组相比，重组NGF干预可降低Bax和cleavedCaspase-3蛋白表达的水平，增高p-Akt，Bcl-2的表达水平。
结论：
NADPH氧化酶抑制可阻止缺氧诱导的心肌细胞NGF的减少。NGF可通过激活Akt，增加Bcl-2降低Bax和cleavedCaspase-3的表达来抑制细胞凋亡。这些结果提示NADPH氧化酶激活介导心梗后缺氧诱导的NGF表达降低，NGF降低可促进缺氧诱导的心肌细胞凋亡。